Скрининг с помощью антител

Л. Скрининг с помощью антител [c.70]

Помните, что необходимо отбирать для анализа супернатанты из лунок с хорошим ростом гибридом такая проба будет содержать оптимальное количество антител. Очень простой радиоиммунологический метод может быть использован для тестирования адекватных уровней антител в супернатантах и для повседневного контроля за образованием антител в лунках [13]. Особую ценность данный метод приобретает в том случае, если наблюдается рост в большом числе лунок, а скрининг супернатантов еще не дает положительных результатов. Обнаружение с помощью антиглобулиновых реагентов значительных титров антител означает, что чувствительность первичного скрининг-теста недостаточна и его необходимо усовершенствовать. Если выявляют мышиные иммуноглобулины в незначительной концентрации, то необходимо подождать, пока гибридомные клетки вырастут, а затем взять повторные пробы для скрининга. Можно сконцентрировать анализируемые супернатанты, хотя обычно в этом нет необходимости. [c.135]

В разд. 5 мы рекомендовали выбирать метод скрининга, адекватный использованию МКА. Следует иметь в виду, что в неадекватных системах МКА иногда не обнаруживают антигена. Например, моноклональные антитела к растворимым белкам, отобранные методом пассивной гемагглютинации с помощью эритроцитов, нагруженных антигеном, могут распознавать только одну антигенную детерминанту. Такие антитела не обладают преципитирующими свойствами. В таком случае преципитация антигена достигается при использовании комбинации моноклональных антител различной специфичности, которые распознают две различные детерминанты на молекуле белка. [c.149]

До появления клонотек пептидов улучшение их биологических свойств осуществляли путем последовательного синтеза большого числа аналогов и проверкой их биологической активности, что требовало больших затрат времени и средств. В последние годы появилась возможность с помощью автоматических синтезаторов создавать за короткое время тысячи различных пептидов. Разработанные методы направленного мутагенеза также позволили резко расширить число белков, получаемых одновременно и последовательно тестируемых на биологическую активность. Однако только недавно разработанные подходы к созданию клонотек пептидов привели к получению миллионов последовательностей аминокислот, требуемых для проведения эффективного скрининга с целью выявления пептидов, максимально удовлетворяющих предъявляемым критериям. Такие клонотеки используются для исследования взаимодействия антител с антигенами, получения новых ингибиторов ферментов и антимикробных агентов, конструирования молекул, обладающих требуемой биологической активностью, или придания новых свойств белкам, например, антителам. [c.337]

Отбор фаговых частиц, экспрессирующих антитела требуемой специфичности, как правило осуществляется с помощью отдельных антигенов, иммобилизованных на твердом носителе с использованием 96-луночных плашек для микротитрования и стандартного иммуноферментного метода [269]. Разработаны и высокопроизводительные методы скрининга с применением микроматриц антигенов, иммобилизованных на мембранах [269]. Сам отбор проводят в виде двух-трех последовательных раундов, каждый из которых включает сорбцию фаговых частиц, экспрессирующих соответствующие антитела, на носителях с иммобилизованным антигеном, отмывку несвязавшихся частиц, элюирование оставшихся связанными и размножение полученных рекомбинантных бактериофагов. [c.426]

После удачного слияния клеток необходимо провести быстрый и эффективный скрининг гибридом. В большинстве случаев дл-ч слияния требуются три этапа скрининга, и поскольку для каждого эксперимента используется свыше 500—1000 лунок, это означает, что для выявления наличия специфических антител нужно проанализировать до 3000 проб. Кроме того, кинетика роста гибридных клеток такова, что результаты скрининга должны быть известны в течение первых 48 ч после отбора проб. Единственный реальный способ обработать такое количество проб — использование метода, который позволяет провести скрининг, дающий визуальные результаты, на планшетах с лунками маленького объема. Скрининг не обязательно дает абсолютно однозначные результаты и допускается выявление некоторого количества ложных положительных клонов. Затем его можно повторить и получить более определенный ответ, работая только с относительно небольшим количеством проб, давших положительный ответ при первом скрининге. Один из наиболее удобных методов скрининга — твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA), при котором антиген наносится на дно лунок пластикового планшета он связывает антитела, продуцируемые гибридомой, а наличие этого комплекса обнаруживается с помощью антител к иммуноглобулинам, конъюгированных с определенным ферментом. Описание иммуноферментного анализа (ИФА) приведено в табл. 6.6. [c.185]

При создании комбинаторных библиотек вместо фага X можно использовать нитевидные бактериофаги М13 или fd (рис. 10.14). В этих случаях соответствующий фрагмент антитела синтезируется как часть химерного белка, локализованного на поверхности фаговой частицы. Скрининг комбинаторной библиотеки фрагментов антител можно провести при помощи ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA). Суть метода состоит в следующем образцы (аликвоты) из библиотеки помещают в ячейки планшеты, содержащие антиген-мишень. Ячейки промывают, чтобы удалить несвязанные фаговые частицы. В каждую ячейку вносят конъюгат, состоящий из антитела, связывающегося с белком фаговой оболочки, и фермента. Ячейки промывают для удаления несвязанного конъюгата и добавляют в каждую из них хромогенный субстрат, который расщепляется ферментом, связанным с фагом, и окраши- [c.219]

Для выявления рекомбинантных клонов, синтезирующих экзоглюканазу, использовали иммунный скрининг, позволяющий идентифицировать белок-мишень с помощью специфичных к нему антител секреция белка при этом необязательна. Рекомбинантные клетки лизи-ровали in situ (парами хлороформа), перенесли цитоплазматические белки на найлоновый или нитроцеллюлозный фильтр и провели иммунологический тест. Использованный при этом метод реплик позволил сохранить жизнеспособные клетки для дальнейших исследований. [c.298]

Большинство антигенов вызывает в организме образование целого набора антител, но каждый отдельно взятый лимфоцит продуцирует лишь одно из них. Миеломы — это злокачественные новообразования иммунной системы они развиваются в результате неконтролируемой пролиферации одной линии лимфоцитов. При этом в больших количествах синтезируется один тип белков-антител. Иными словами, миеломы являются природными продуцентами моноклональных антител. По методу Миль-штейна проводят слияние нормальных (неопухолевых) лимфоцитов и клеток миеломы. Вначале полученные гибриды синтезируют смесь антител, включающую два типа антител родительских клеток, а также гибридные их формы, образующиеся путем ассоциации тяжелых и легких цепей антител двух родительских форм. Впоследств ии в результате элиминации хромосом образуются клетки, способные к синтезу антител лишь одного типа. Это могут быть либо антитела, закодированные в геноме лимфоцита, либо антитела, характерные для клеток миеломы. Скрининг и обнаружение клона, синтезирующего искомое антитело, ведут при помощи биохимических и иммунохими-ческих методов. Схема этого метода дана на рис. 7.5. [c.313]

Другие методы идентификации рекомбинантных плазмид основаны на экспрессии включенного в них гена. При этом идентифицируется белковый продукт, для чего используются иммунологические методы или методы определения его специфической активности. Для обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга, на основе специфического их взаимодействия с антителами, часто используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизиро-ванных бактерий связываются с антителами на диске. Положение антигенов, адсорбированных на диске, определяют с помощью радиоавтографии. [c.316]

Имеются антитела к белку (белкам), с помощью которых путем скрининга библиотеки экспрессирующихся клонов (например, клонированных в Xgtll) выделен предположительно соответствующий клон ДНК. Задача сводится к проверке этого [c.141]

Трудности, с которыми можно столкнуться при наработке моноклональных антител, связаны с получением достаточного количества иммуногена и последующим скринингом сыворотки для выявления нужной иммунологической активности. Использование гиперэкспрессии гибридных белков может облегчить преодоление этих трудностей, поскольку дает возможность выделять большие количества белкового продукта с помощью электрофореза или хроматографии. При скрининге сыворотки и полученных затем гибридных клонов можно применять метод радноиммунного анализа (РИА, RTA) или метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). [c.173]

Другой способ скрининга удивительно универсален. Как показал наш опыт —это прямое иммуноцитохимическое окрашивание фиксированных клеток (табл. 6.7). Данный метод очень удобен, поскольку под микроскопом приходится исследовать содеожимое только тех лунок, в которых после добавления субстрата развилась окраска, а характер распределения субстрата может дать большую информацию о специфичности антител. Поскольку планшеты могут храниться, с их помощью удобно исследовать взаимодействие антител, получаемых в результате одного слияния, с разными клеточными линиями. Возможности метода позволяют, кроме того, исследовать инфицированные вирусом или стабильно трансформированные клеточные линии. [c.185]

Недавно методом иммунохимического скрининга с помощью моноклональных антител к компонентам поверхности синап-тосом идентифицирован новый фосфопротеин Р 1-20 (N15. = 190 кД), который локализуется в синапсах головного мозга, причем его содержание начинает резко возрастать после 7 дня постна-тальной жизни животного. Показано, что этот фосфопротеин является так же, как и фодрин (см. раздел 3.1), субстратом для калпеина нейронов. [c.76]

На ДНО контейнера помещают немного хлопковой ваты, чтобы избежать повреждения кончиков пипеток. Пастеровские пипетки присоединяют к насосу, полностью удаляют жидкость ИЗ лунок и вносят в них по 0,2 мл среды ГАТ (иногда вместе с 5% лошадиной сыворотки), используя для этой цели многоканальную пипетку. Таким образом обрабатывают все панели л снова помещают их в термостат. Через 2 дня среда во многих лунках, как правило, опять становится желтой. Как раз в 4ЭТ0 время необходимо проверить супернатанты на содержание антител. Можно тестировать отдельные лунки по мере того, как среда в них желтеет, или подождать, пока это не произойдет в большинстве лунок, и тогда протестировать сразу все супернатанты. Первая процедура, которой следует отдать предпочтение, если используется трудоемкая система анализа, заключается в удалении почти всего супернатанта с помощью ластеровской пипетки и переносе его в пронумерованные панели для тестирования. Прежде чем приступить к тестированию среды в следующей лунке, предыдущую следует заполнить свежей средой. Чрезвычайно важно избегать переноса клеток из одной лунки в другую. Пастеровскую пипетку можно простерилизовать с помощью кипящей воды, набираемой и вновь выпускаемой из пипетки, и охладить, набирая холодную среду. Лишь затем эту пипетку используют для работы со следующей лункой. Если применяют простую систему анализа . (например, реакцию пассивной гемагглютинации), то проще и информативнее отбирать пробы со всей панели, используя многоканальную пипетку. Технология скрининга рассматривается [c.128]

Существует определенная схема выявления специфического связывания антител с антигеном. Клетки-мишени могут быть живыми, зафиксированными глутаровым альдегидом, высушенными на стекле или же присутствовать в замороженных гистологических срезах. Тест неизбежно является непрямым, и реагентом для второй стадии могут служить антимышиные иммуноглобулины овцы, козы или кролика, меченные флуоресцеином, ферментом или радиоактивным иодом. Обычно пробу (одну каплю) супернатанта добавляют к 0,5-10 клеток-мише-ней в небольшом объеме в маленькой пластиковой пробирке или в лунке панели. После 30—60 мин инкубации при 4°С суспензию разбавляют, клетки осаждают центрифугированием, отмывают один раз и инкубируют в течение 30 мин при 4°С с соответствующими разведениями поливалентного антимышино-го иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцеином. Клетки вновь отмывают и регистрируют флуоресценцию непосредственно под флуоресцентным микроскопом или с помощью проточного цитофлуориметра системы FA S [14]. Более детально упоминаемые процедуры скрининга изложены в кн. 2. [c.136]

Последняя проблема, которую необходимо решить, — это проблема скрининга. Важно иметь надежную методику для простого и точного скрининга культуральных жидкостей отдельных клонов на содержание антител нужной специфичности. Избранный метод (например, РИА, ELISA и т. д.) должен быть чувствительным и должен давать по возможности количественную информацию. Анализ, основанный на связывании флуоресцент-номеченных антител (иммунофлуоресцентный метод, ИФМ), требует наличия 0,2—1 мкг МА в 25 мкл культуральной жидкости. При этом с его помощью можно определять большинство типов детерминант клеточных поверхностей. Этот метод дает также количественную информацию о среднем числе молекул, экспрессируемых на одной клетке, что является немаловажным преимуществом в случае низкоаффинных МА. Поскольку [c.178]

ИФМ имеет ряд существенных преимуществ перед цитоток-сическими тестами, ELISA и РИА. Во-первых, с помощью ИФМ можно определять молекулы, присутствующие на клеточных поверхностях с плотностью до нескольких тысяч копий на клетку. Во многих случаях, когда методы ELISA на клеточных поверхностях, цитотоксические тесты или РИА оказываются недостаточно чувствительными, антигены плазматической мембраны удается определить с помощью ИФМ. Во-вторых, при исследовании ИФМ имеется возможность достаточно просто детектировать антитела практически всех классов иммуноглобулинов. Например, в настоящее время имеется несколько видов мышиных МА против каппа-легких цепей иммуноглобулинов крыс. Поскольку от 90 до 95% всех иммуноглобулинов крыс содержат каппа-легкую цепь, эти МА существенно улучшают возможности скрининга. В отличие от этого в цитотоксических тестах желательно, чтобы МА принадлежали к классу IgM, так как при этом фиксация комплемента обеспечивается с наибольшей эффективностью. В-третьих, при проведении ИФМ на проточном флуорометрическом клеточном сортере (ПФКС) для каждого определения связывания антител анализируется большое число клеток. Если для каждого образца имеется возможность просчитывать 5—10-10 клеток, то значительно уменьшается вероятность ошибок. [c.179]

Для того, чтобы выделить из клонотеки пептиды с искомой биологической активностью, применяют различные методы скрининга. В частности, для выделения пептидов, имитирующих определенные эпитопы, используют биотинилированные моноклональные антитела (mAb) соответствующей специфичности, которые иммобилизуют на твердой подложке с помощью стрептавидина (рис. 47). Фаговые частицы, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие эпитопы, взаимодействуют с антителами и задерживаются подложкой, тогда как другие рекомбинантные фаговые частицы удаляются в процессе промывания. Задержанные на подложке фаговые частицы элюируют буфером с низкими значениями pH, индивидуальные клоны дополнительно размножают в бактериальных клетках, и экспрессированные на них эпитопы исследуют по различным критериям. Наличие идентичных или сходных последовательностей нуклеотидов среди клонированных последовательностей свидетельствует о специфичности процесса очистки. Индивидуальные клоны затем охарактеризовывают другими, в частности иммуноферментными методами. На заключительной стадии осуществляют синтез выделенных пептидов и их всестороннее изучение в очищенном состоянии. [c.342]

Показаны три рекомбинантных фаговых частицы, экспрессирующие разные эпитопы в составе белка рШ. Только эпитоп центральной фаговой частицы распознается молекулой биотинилированного антитела, иммобилизованного на чашке Петри с помощью стрептавидина и использованного для скрининга клонотеки [c.343]

Значительная часть Т-клеток, экспрессирующих цепь vpe.l, распознает антиген Mls-1 . Путем слияния Т-лимфобластов (экспрессирующих vp8.1 или Vp8.2), выделенных из лимфатических узлов мышей линии B10.br (М1а-1 ), с вариантом Т-клеточной тимомы BW5147 (не экспрессирующей ни Va, ни vp) были получены Т-клеточные гибридомы. Клетки-гибриды отделяли при помощи скрининга с использованием антител, распознающих vpe.l и (для сравнения) VP8.2, затем исследовали реактивность гибридом в отношении антигенов Mls-1 на поверхности клеток-стимуля-торов Н-2 . Подавляющее большинство гибридом, реагирующих на антиген Mls-1 , экспрессировало VP8.1 и незначительное - VP8.2. Эти результаты показывают, что в распознавании антигена Mls-1 главную роль играет цепь vp8.1. [c.251]

Скрининг - выявление частоты нераспознанной заболеваемости с помощью быстродействующих тестов. Как правило, скрининг предполагает плановое тестирование в рамкг х всей популяции или отдельных групп внутри популяции. Серологический тест на наличие у человека антител к ВИЧ стал широко доступен с 1985 г. В массовой практике тестирования и скрининга чаще всего используются методы иммуноферментного анализа, которые, однако, могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. [c.344]

Другой метод скрининга применяют при клонировании клеток животных, в которых экспрессируется рекомбинантный ген (или ьДНК), кодирующий секретируемый полипептид. При этом используют клетки хозяина, в норме не образующие полипептид, и тестируют среду, в которой находятся трансформированные клетки, на присутствие в ней данного полипептида. Если продуктом является гормон, то его присутствие в среде можно обнаружить с помощью какого-либо удобного высокочувствительного биологического метода. Таким же способом бьши клонированы гены, кодирующие факторы роста, которые стимулируют пролиферацию специфических клеток-мишеней. Если активность полипептида как такового трудно измерить, то используют специфичные к нему антитела. Этот метод непригоден для одновременного скрининга большой популяции клонированных клеток, содержащих разные рекомбинантные молекулы, поскольку для этого пришлось бы проводить слишком много (возможно, миллион) отдельных тестов. Вместо этого смесь трансформированных клеток подразделяют на удобное число отдельных групп и тестируют эти группы. Группу, дающую положительный ответ, снова подразделяют на подгруппы, вновь вьщеляют позитивную подгруппу, подразделяют ее, тестируют и так далее до тех пор, пока не будет идентифицирован один позитивный клон. [c.300]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология