Карбоксипептидаза структурные исследования

Для карбоксипептидазы А (КПА) из поджелудочной железы быка известны и трехмерная структура [1—3], и полная аминокислотная последовательность [4]. Роль существенно важного металла установлена менее определенно, но она доступна изучению с помощью разнообразных спектроскопических [5, 6] и кинетических [7, 8] методов. Следовательно, этот фермент можно включить во все увеличивающийся список белков, для которых возможно провести корреляции структуры и функции. Любой предлагаемый механизм катализа под действием КПА должен теперь учитывать как накопленные химические данные, так и взаимодействия, наблюдавшиеся при структурном исследовании кристаллов комплекса карбоксипептидазы с модельным субстратом глицил-ь-тирозином [3, 9]. [c.504]

Рассмотренный материал об аспартатных протеиназах, как и подобный материал о химотрипсине, трипсине, карбоксипептидазе и лизоциме, изложенный ранее [400], дает основание заключить, что появление уникальной количественной информации о пространственном строении ферментов и их комплексов не привело к концептуальному развитию энзимологии и переосмыслению сложившихся представлений о природе биокатализа. Ставшие доступными рентгеноструктурные данные не вызвали принципиальных изменений в понимании явления ферментативного катализа и не нашли строгого объяснения в рамках сформулированных в 1950-е годы концепций, равно как и наоборот — последние не получили на основе новых структурных данных своей объективной трактовки. Данные рентгеноструктурного анализа о трехмерных структурах ферментов не изменили направленность исследований каталитических реакций "от функции к структуре", которой энзимология следует с момента своего становления, т.е. более 150 лет. [c.105]

Этот вопрос является как нельзя более уместным, поскольку все данные о структурных особенностях ферментов и механизме их действия были получены при исследовании кристаллических белков. Когда-то ответить на поставленный выше вопрос было довольно трудно, но имеющиеся в настоящее время данные, как правило, дают положительный ответ. Сомнения остаются лишь относительно активного центра карбоксипептидазы (гл. 12), да и то только по поводу подвижной боковой цепи остатка тирозина. [c.26]

В результате структурных исследований удалось показать что а-МСГ представляет собой амид К-ацетилтридекапептида последовательность аминокислотных остатков которого совпа дает с последовательностью первых 13 аминокислот адренокор тикотропина (табл. 6). При этом не найдено каких-либо видо вых различий так, идентичные образцы а-МСГ были выделены из гипофиза свиньи [944, 950, 1357], быка [790, 1396], лошади [609], овцы [790] и обезьяны [1360]. В соответствии с этим обозначения ас-МСГ, аб-МСГ, ад-МСГ, ао-МСГ, об-МСГ и ч-МСГ отвечают меланотропинам гипофиза свиньи, быка, лошади, овцы, обезьяны и человека. Во всех случаях последовательность аминокислот а-МСГ определяли с помощью частичного кислотного гидролиза, а также расщепления карбоксипептидазой, химотрипсином и трипсином. На рис. 47 показаны пептиды, образующиеся при ферментативном расщеплении а-меланотропина гипофиза обезьяны. Строение Рс-МСГ, являющегося, как пока- [c.228]

Работа Бергмана и сотрудников [47] увеличила наши сведения о специфичности протеиназ, но еще многое осталось сделать в отношении их очистки и выделения. Такие ферменты, как карбоксипептидаза, аминопептидаза и протамииаза особенно пригодны для структурных исследований. Можно надеяться, что доступность кристаллической карбоксипептидазы может открыть путь для строгой проверки однородности этого фермента и затем для экспериментальной оценки специфичности его субстрата, что позволит найти этому ферменту более широкое применение. [c.220]

В части 1 книги, посвященной структурным и электронным аспектам исследования роли ионов металлов в белках, сначала речь идет о возможностях и разрешающей способности рентгеноструктурного анализа белков. Здесь обсуждаются интересные и для неоргаников, и для биохимиков проблемы установления кристаллической структуры макромолекулярных веществ. При рассмотрении каждого примера сделана попытка соотнести кристаллографические данные с результатами, полученными такими методами, как измерение магнитной восприимчивости, электронный парамагнитный резонанс, поляризационная спектроскопия монокристаллов. В этой части рассматриваются гемовые белки, цинксодержащие металлоферменты, а также кобальт-, медь-, кадмий-, ртуть-, никель-, и марганецзамещенные карбоксипептидазы. Приведены данные по белкам, связывающим кальций. [c.9]

Карбоксипептидазы А и В образуются при гидролизе трипсином соответствующих прокарбоксипептидазных предшественников, синтезируемых в поджелудочной железе [187J. Из этих двух ферментов более подробно изучена карбоксипептидаза А, и проведено ее детальное исследование методом рентгеноструктурного анализа [29, 188, 189]. Карбоксипептидаза А быка (КПА) представляет собой фермент, содержащий 307 аминокислот в единственной полипептидной цепи, которая прочно связывает 1 г-ион Zn(II) на 1 моль фермента. Необходимость Zn(ll) для ферментативной активности была впервые продемонстрирована тем, что КПА, свободная от иона металла, неактивна, но активность восстанавливается при добавлении Zn(II) [190, 191]. По-видимому, фермент, не содержащий металла, в основном сохраняет структурные свойства активной КПА [191]. Позже на основе данных рентгеноструктурного анализа [29] было четко установлено, что роль иона Zn(ll) при гидролизе пептидов заключается в связывании субстрата. При протеолизе фермент проявляет стереохимическую специфичность, отщепляя С-конце-вую аминокислоту от пептидной цепи только в том случае, если С-концевая карбоксильная группа свободна и если аминокислота имеет L-конфигурацию [192, 193]. Обычно наблюдается более высокая активность, если остаток С-концевой аминокислоты содержит ароматическую группу или разветвленную цепь [194]. [c.76]

На основе рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением проведено сравнение стереохимических свойств трех типов взаимодействий металл—белок. Для установления структурных и электронных факторов, ответственных за регуляцию активности иона металла, рассмотрены координационные центры металл — лиганд в белках и прослежена связь между молекулярной структурой, стереохимией и электронной структурой и биологической ролью функции иона металла. Гидро( бное взаимодействие порфиринового кольца гемоглобина и миоглобина рассмотрено по данным измерений магнитной восприимчивости, спектроскопии парамагнитного резонанса и исследования поляризационных спектров поглощения монокристаллов. С точки зрения электронной конфигурации (1-орбиталей и геометрии координации обсуждается взаимодействие замещенных ионов металлов в карбоксипептидазе А с карбонильной группой субстратов при гидролизе пептидов. Предполагается, что спектральные изменения, зависящие от pH и наблюдаемые в спектре электронного поглощения, замещенного иона Со(П), каталитически активного в карбоангидразе, обусловлены образованием упорядоченной структуры растворителя вблизи иона Со(И), Корреляция между молекулярной структурой, определенной методами рентгеноструктурного анализа, и электронной структурой координационного центра металл — лиганды, оцененной из спектроскопических данных, указывает на происхождение структурной регуляции реакционной способности иона металла в белках и ферментах. [c.123]

Карбоксипептидаза также обусловливает превращение белков, в результате которого образуются растворимые соединения без заметного изменения молекулярного веса, а иногда и без потери биологической активности. Карбоксипептидаза способна выделять аминокислоты из некоторых белковых субстратов, воздействуя главным образом на С-концевые положения, которые соответствуют ее специфическим структурным требованиям. В течение последних двух лет Карбоксипептидаза исследовалась как возможный общий реагент, пригодный для осуществления контролируемого постепенного расщепления белков и для идентификации С-концевых аминокислот. Этот вопрос рассмотрен в статьях II и III, однако не следует недооценивать преимуществ применения карбоксипептидазы и в исследованиях изменения белков под действием ферментов. При повторном исследовании биологической активности инсулина, обработанного карбоксипеп-тидазой, Гаррис и Ли [151ж], данные которых противоречат ранее [c.336]

Метод теоретического конформационного анализа был использован для изучения невалентных взаимодействий а-химотрипсина с рядом простейших субстратов, лизоцима с триацетилглюкозамином, рибонуклеазы с уридин- 2, З -циклофосфатом, карбоксипептидазы А с пептидными и эфирными субстратами. К сожалению, в силу ограниченной точности этот метод не всегда дает однозначный ответ о наличии напряжений в комплексе. Тем не менее обилий вывод из проведенных теоретических исследований состоит в следуюш ем. Хотя образование комплекса Михаэлиса сопровождается конформационными изменениями, однако посадка субстрата не вызывает в молекулах субстрата и фермента ни избыточного конформационного напряжения, ни образования какой-либо принудительной конформации. На а-химотрипсине было показано, что в предкаталитической стадии структурные элементы его активного центра находятся в ненапряженном состоянии. [c.423]

Насколько геометрические параметры реальных конформационных состояний полипептидной цепи отличаются от параметров так называемых вторичных структур, можно судить по рис. П.З, на котором показано распределение на конформационных картах ф—ф остатков некоторых сегментов цепей а-химотрипсина, карбоксипептидазы А и лизоцима [61]. Во всех исследованиях, посвященных поиску эмпирических корреляций, эти сегменты отнесены к а-спиральным или -структурным. Из рис. П.З видно, что в экспериментально наблюдаемых конформационных состояниях остатков, включенных при статистической обработке во вторичные структуры, значения двухгранных углов ф, ф не только не выражаются в точки ( фц, фц) и ( фр, фр), что должно иметь место при строгой регулярности структур, а обнаруживают существенный разброс в пределах а- и -областей. Более того, в ряде случаев значения ф, ф остатков а- и -сегментов вообще находятся в совершенно других местах конформационной карты. Если ограничить отклонения а-спиральных углов ф, ф от стандартных значений, например 15°, то в трех приведенных примерах в а-спиральных сегментах окажется не 41 остаток, а лишь 18 что же касается -структуры, то при таком ограничении углов ф, ф в нее не попадет больше двух остатков. Если же исключить из структур, считающихся вторичными, по три остатка с их N- и С-концов, которые, как правило, имеют большие отклонения по углам ф, ф или отвечают другим конформационным состояниям, то содержание в глобулярных белках участков, действительно близких к регулярным, уменьшится по сравнению с принятыми в литературе в 2—3 раза. При введении количественного критерия регулярности нельзя уже будет считать вторичными структурами большинство коротких а-спиралей и -структур, в том числе и большинство спиралей из 4—9 остатков, которые являются самыми распространенными в белках. В связи с тем, что в реальных белках вторичные структуры не обладают правильными регулярными формами, их идентификация субъективна и существенно отличается у разных авторов. Например, в лизоциме Чоу и Фасман [99] к а-спиралям и -структурам относят соответственно 54 и 21 остаток, а Бэржес и соавт. [101] — 46 и 4 в субтилизине BPN (отнесения [101] даны в скобках) — 86 (69) и 27 (44), в папаине — 54 (50) и 30 (21). Подобных примеров можно привести очень много. [c.269]

Из кристаллографических данных следует, что механизмы активации трипсиногена и химотрипсиногена сходны [26]. Исследование методом кругового дихроизма ацилферментных интермедиатов, образующихся в ходе катализа трипсином и трипсиногеном, показало, что субстрат связывается с ферментом и с зимогеном по-разному. Интересно, что присоединение N-концевого дипептида трипсина Ile-Val (табл. 3.3) к трипсиногену индуцирует переход последнего в трипсиноподобную конформацию и, наоборот, блокирование N-концевого Не в молекуле трипсина индуцирует конформацию, подобную таковой у трипсиногена [26, 27]. Степень гомологии аминокислотных последовательностей двух изоферментов — карбок-сипептидаз А и В —составляет 51% [28]. Третичная структура карбоксипептидазы А (но не карбоксипеп-тидазы В) установлена с разрешением 0,2 нм конформации зимогенов и, следовательно, структурные изменения, сопровождающие активацию, неизвестны. [c.44]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология