Мембранные белки, солюбилизация детергентами

Рис. 6-18. Солюбилизация мембранных белков с помощью детергента. Детергент разрушает липидный бислой, в результате чего белки оказываются в растворе в виде комплексов с молекулами липидов и детергента Фосфолипиды мембран также солюбилизируются с помощью детергента.

Рпс. 3.11. Солюбилизация мембраны неионным детергентом тритоном Х-100. Детергент размещается на гидрофобном участке белка и замещает мембранные липиды. Если концентрация детергента ниже его ККМ, белок сам образует мицеллы или агрегаты, которые часто выпадают в осадок, [c.84]

Детергенты — это группа амфифильных соединений, которые способны связываться с гидрофобными участками мембранных белков, контактирующими с липидной фазой мембран, тем самым разрушая ее структуру. В ходе солюбилизации мембран детергентами последние модифицируют бислой липидов, разрыхляя его, затем образуют смешанные (белок-липид-детергентные) мицеллы, а в конечном итоге — детергент-белковые и липид-детергентные мицеллы. Для сохранения мембранных белков в растворимом состоянии необходимо постоянное присутствие детергента. Его удаление приводит к агрегации и последующему осаждению молекул белка. [c.224]

При хроматографии и электрофорезе белков использование органических растворителей исключается из-за их денатурирую щего действия, в результате которого белки переходят в нерастворимое сйстояние. Подобное действие могут оказывать и некоторые органические соединения. Поэтому при разделении белков необходим тщательный выбор селективных водных буферных систем. Однако необходимость солюбилизации белков, в особенности тех из них, которые ассоциированы с биологическими мембранами, привела к введению детергентов — как ионных, так и неионных, а также таких реагентов, как мочевина и гидрохлорид гуанидина, которые разрывают водородные связи и препятствуют гидрофобным взаимодействиям. Даже будучи денатурированными, многие белки остаются растворимыми в присутствии этих соединений, особенно после расщепления ди-сульфидных связей дитиотретиолом или меркаптоэтанолом. [c.105]

Авторам работы [630] удалось растворить мембранные ферменты в водно-органических растворах при низких температурах, избежав общепринятого метода солюбилизации с помощью детергентов путем образования мицелл в водных растворах. Они удалили липидные компоненты при —75 °С, при этом белок остался в нативном состоянии и сохранил активность. Таким образом, при низких температурах в растворителях, подобных смеси хлороформ—метанол, ферментативная активность не теряется, что открывает большие возможности в изучении мембранных белков. [c.238]

Поскольку большинство детергентов используется в концентрациях, довольно сильно превосходящих ККМ, и поскольку действие детергентов обусловлено образованием смешанных мицелл с липидами или связыванием с белками, отношения детергент белок или детергент липид значительно важнее истинной концентрации детергента. Как правило, достаточный избыток детергента обеспечивается при соотношении 2—4 мг детергента к 1 мг белка. Например, если для солюбилизации мембран используется 2%-ный тритон Х-100, концентрация белка в пробе должна быть не больше 5—10 мг/мл. [c.154]

Мембранные структуры могут быть подвергнуты солюбилизации. Этот процесс обеспечивается детергентами — группой амфи-фильных соединений, способных связываться с мембранным белком гидрофобными связями, одновременно взаимодействуя полярными группами с водой. В результате молекулы детергента сначала разрыхляют мембрану, при повышении их концентрации образуют смешанные мицеллы, а затем и детергент-белковые комплексы (рис. 35). В ряде случаев при замене липидного окружения на детергент белок сохраняет хотя бы некоторые свои функции. [c.87]

Важным показателем является также агрегационное число детергента количество молекул, входящих в состав одной мицеллы. Из табл. 14 видно, что по этому показателю детергенты группы А сильно отличаются от детергентов группы В первые образуют выраженные мицеллярные структуры, в то время как вторые способны лишь образовывать агрегаты из нескольких молекул. В соответствии с различиями в структуре, определяющими эти свойства, детергенты группы А способны не только внедряться в мембранный бислой, но и солюбилизировать его, образуя собственные мицеллы с встроенными в них мембранными белками. На рис. 35 приведена схема солюбилизации мембран детергентом группы А. Детергенты группы В, не способные образовывать собственные мицеллы, могут лишь встраиваться в мембранный бислой или в мицеллы, образованные детергентами группы А. [c.89]

С помощью разнообразных методов фракционирования мембранные белки в солюбилизированной форме могут быть разделены и очи-шены до инднандуального состояния. Последующее удаление детергента в присутствии подходящих фосфолипидов позволяет реконструировать в искусственной мембране ту илн иную функцию изучаемого белка. В таблице 23 приведены структурные формулы н названия детергентов, наиболее часто используемых для солюбилизации и реконструкции мембран. [c.560]

Наиболее широко распространенным детергентом, применяемым для солюбилизации мембран, является ДСН. В концентрации более 1% он переводит в растворимую форму, по-видимому, все мембранные белки бактериальных [613] и эукариотических [358, 755, 829, 896] клеток. При использовании ДСН в более низких концентрациях достигается лишь частичная солюбилизация мембранных компонентов [781], что позволяет фракционировать белки в соответствии с растворимостью их комплексов, образующихся при разных концентрациях ДСН [167]. Присутствие мочевины [766, 776] и обработка ультразвуком [1041] способствуют солюбилизации белков в ДСН. [c.316]

Рис. 2.4. Действие детергента при солюбилизации мембранного белка. В зависимости от соотношения белка и детергента в растворе солюбилизированный белок может находиться в состоянии, показанном на рисунке, или образовывать с детергентом более сложную мицеллу.

В 1971 г. Ф. Сенгер и Г. Николсон предложили жидкостно-мозаичную модель биомембран, согласно которой мембраны представляют собой жидкокристаллические структуры, в которых белки могут быть не только на поверхности мембран, но и пронизывать их насквозь. В этом случае основой мембраны является липидный бислой, в котором углеводородные цепи фосфолипидов находятся в жидкокристаллическом состоянии, и с этим бислоем связаны белки двух типов периферические и интегральнь1е. Первые - гидрофильные, связаны с мембранами водородными и ионными связями и могут быть легко отделены от липидов при промывании буфером, солевым раствором или при центрифугировании. Вторые белки - гидрофобные, находятся внутри мембраны и могут быть выделены только после разрушения липидного слоя детергентом (процесс солюбилизации мембран), например, додецилсульфатом натрия, ЭДТА, тритоном и др. Интегральные белки, как правило, амфипатические, т.е. своей гидрофобной частью они взаимодействуют с жирными кислотами, а гидрофильной частью - с клеточным содержимым. Интегральные белки часто являются гликопротеидами, которые синтезируются в аппарате Гольджи, глико-зилируются в мембране и содержат много гидрофобных АК и до 50% спиральных участков. Эти белки перемещаются внутри липидного бислоя со скоростью, сравнимой с перемещением в среде, имеющей вязкость жидкого масла ( море липидов с плавающими айсбергами белков ). [c.107]

Детальному рассмотрению свойств биологических мембран посвящена гл. И. Здесь следует лишь подчеркнуть, что липиды образуют матрицу биологических мембран, а мембранные белки как бы закреплены в ней. Многие мембранные белки практически невозможно перевести в водный раствор без разрушения мембран. С целью солюбилизации мембранных белков широко используются детергенты (сурфактанты), особенно нейтральные, такие, как детергенты ряда тритона-Х. Считается, что детергенты этого типа включаются в состав мембранных бислоев, и после насыщения мембран детергентом образуются смешанные мицеллы, содержащие и детергент, и мембранные липиды, а белки переходят в раствор. [c.92]

Рис. 10.17. Структуры детергентов, используемых для солюбилизации и очистки мембранных белков.

Основной проблемой очистки белков является подбор детергента и оптимальных условий солюбилизации их молекул. Детергент не должен нарушать высшие типы пространственной организации белков, а лишь замещать молекулы липидов, контактирующие с гидрофобными участками белковой глобулы. Критерий максимальной солюбилизации белка — переход его молекул в надосадочную жидкость после осаждения мембран. Причем важным требованием процедуры солюбилизации является сохранение функциональной активности биополимера и его стабилизация. Для этого в исследуемую систему добавляют экзогенные фосфолипиды, глицерин, ингибиторы протеаз. Следует отметить, что получаемые при очистке белок-детергентные комплексы могут содержать значительные количества связанных фосфолипидов, что необходимо учитывать при дальнейшем разделении и характеристике получаемого препарата белка. [c.224]

Действительно, если контролировать солюбилизацию мембранных фосфолипидов детергентами с помощью высокочувствительных методов, можно убедиться, что повышение концентрации детергента экстрагирует из нативной мембраны все имеющиеся там липиды с одинаковой скоростью, не различая прочно связанные (аннулярные) и свободные липиды (рис. 19). Более того, использование спин-меченых фосфолипидов в процессе реконструкции различных мембранных ферментов позволило измерить скорость обмена молекул фосфолипидов между аннулярным слоем и окружающими липидами. Для разных белков обнаруживается своя доля иммобилизованного липида. По вытеснению метки из аннулярного слоя при добавлении немеченого липида можно определить сродство каждого липида к поверхности белка. Характерно, что значения стехиометрии связывания белком пограничных липидов, измеренные этим методом и рассчитанные из геометрических размеров молекулы белка, практически совпадали. [c.43]

Для солюбилизации мембранных белков часто используют неионные детергенты, такие как тритон Х-100, твин-80 и др. Эти детергенты влияют на развитие окраски при определении белка с биуретовым реактивом и методом Лоури. Практически полного удаления детергентов из пробы можно добиться экстракцией их изоамнловым спиртом. [c.82]

Необходимо упомянуть также еще об одной области, где практическое знание закономерностей образоаания и поведения мииелляр-ных структур имеет прямое отношение к исследованиям биологических мембран. Речь идет о проблемах разборки мембран на составные компоненты с выделением из них отдельных мембранных белков и последующей реконструкции функционально активных комплексов в модельных системах. В настоящее время наиболее предпочтительным подходом к решению этих проблем является использование детергентов. При действии детергентов на выделенные препараты клеточных мембран происходит солюбилизация белков и. 1НПИД0В с образованием смешанных мицелл (рис. 291). [c.560]

Мембранные белки трудно выделить в виде интактных комплексов, так как они нерастворимы в большинстве водных растворов, а такие вещества, как детергенты и мочевина, необходимые для их солюбилизации, могут нарушать нормальное белок-белковое взаимодействие (разд. 6.2.2). Однако в начале 1960-х гг. было обнаружено, что с помощью относгггельно мягких ионных детергентов, таких как дезоксихолат фис. 7-32), можно солюбилизировать некоторые компоненты митохондриальной внутренней мембраны в нативной форме. Это позволило идентифицировать и выделить три главных связанных с мембраной комплекса дыхательных ферментов на пути от NADH до кислорода (рис. 7-33). [c.452]

Кристаллизация мембранных белков может быть реализована в том случае, когда белок удается очистить до гомогенного состояния без солюбилизации содержащих его мембран в детергентах. Именно к таким белкам относится Ыа" , К+-АТРаза наружного мозгового слоя почек млекопитающих, в частности свиньи. Этот фермент, являющийся натриевым насосом клетки и обеспечивающий создание трансмембранного градиента концентраций ионов натрия и калия, состоит из двух типов субъединиц а и (3, присутствующих в эквимолярных коли- [c.175]

В бислой определенного липидного состава [588, 589]. Широких систематических исследований по двухмерной кристаллизации мембранных белков до настоящего времени не проведено. Поэтому эмпирический подход все еще является основным. Однако результаты, полученные в ходе изучения нескольких мембранных белков, позволяют выделить ряд факторов, влияющих на формирование кристаллов. В общем случае кристаллизация реконструкцией является более многопараме-торным процессом, чем в случае кристаллизации без полной солюбилизации мембран. В зависимости от условий реконструкция белков в липид может приводить к образованию различных структур много- и однослойных протеолипосом, трубчатых структур, плоских мембран. Наиболее удобны для электронно-микроскопического изучения плоские мембраны. Необходимо также, чтобы реконструированный в такие мембраны белок имел "плотную упаковку". Для получения требуемых структур определяющими являются выбор липидов и детергента, концентрация белка и количественное соотношение липид/ белок. Так, при использовании "жидких" липидов варьирование этого соотношения может приводить к появлению всего спектра упомянутых выше структур. Для получения кристаллов обычно приходится проводить изучение влияния на характер упаковки белков в мембранах и таких параметров, как pH, ионная сила, наличие многовалентных ионов. В некоторых случаях необходимо также присутствие специфических лигандов, стабилизирующих белок в одном из конформационных состояний. Существенное влияние могут оказывать также температура и скорость процесса реконструкции, т.е. удаления детергента. [c.181]

Для изучения иммунологических реакций на молекулярном уровне необходимо создание модельных антигенных систем, в которых молекулы-мишени с известными химическими свойствами взаимодействуют с клетками иммунной системы. В случае антигенов клеточных поверхностей модельная система может включать вместо клеток искусственные носители — липосо-мы. Поскольку мембранные белки обычно нерастворимы в воде, с ними работают только в присутствии детергентов, которые способствуют солюбилизации белков, эффективно заменяя липидное окружение. В связи с тем что детергенты токсичны по отношению к живым клеткам, перед проведением опытов на клетках их необходимо удалять. После удаления детергентов в присутствии липидов могут формироваться искусственные мембраны. Когда мембранные белки включаются в образующиеся таким образом липидные пузырьки, они имитируют клеточные антигены и эффективно стимулируют иммунные реакции. [c.150]

Как правило, для солюбилизации мембранных белков используют различные вещества. Одной из групп таких веществ являются ионные и неионные детергенты, органические растворители и их комбинации. Действие этих веществ приводит к солюбилизации мембранных белков, однако, одновременно с этим, вызывает ту или иную степень их модификации или даже денатурации. Чем больше де-натурационный эффект, тем полнее степень солюбилизации мембранных белков. Растворимость белка можно увели- [c.28]

При дозах детергента 0,3 и 0,5 мг на 1 мг белка митохондрий действие дигитонина исследуют также в присутствии 1 М КС1. В случае адсорбции фермента на внутренней мембране митохондрий под действием КС1 возможна эффективная солюбилизация аспартатаминотрансферазы. Это можно установить, определив активность фермента в супернатанте после центрифугирования обработанной суспензии при 20 000g в течение 20 мин. [c.353]

Модификация метода Лоури, делающая его пригодным для измерения белка в пробах, содержащих сахарозу или ЭДТА, а также в препаратах мембран и липо-протеинов, описана Марквеллом и др. [91]. Эта методика основана на применении детергента (додецилсульфата натрия, ДСН) в составе щелочного карбонатного реактива для увеличения солюбилизации липоидных веществ и на использовании повышенного количества тартрата меди для предотвращения помех за счет сахарозы и ЭДТА. Методика применима в нескольких случаях, в том числе при определении белков во фракциях из сахарозных градиентов. [c.358]

При кратковременной инкубации культивируемых in vitro клеток с меченой аминокислотой можно оценить скорость биосинтеза рецепторного белка той или иной специфичности. Для этого после солюбилизации рецепторов с использованием детергентов рецептор определенной специфичности извлекают из смеси на иммобилизованном лиганде. Скорость катаболизма того же рецептора можно оценить после введения в его молекулу радиоактивного иода в мягких условиях. Для этого используют ферментативный метод иодирования (окисляют иод в анионной форме до атомарного в присутствии пероксидазы и пероксидов в качестве субстрата). Клетки с иодированными рецепторами (иодируются только внеклеточные участки рецепторов) сохраняют жизнеспособность. В процессе их культивации можно оценить время, за которое они потеряют меченый рецептор. Для извлечения солюбилизированного рецептора используют как иммобилизованный лиганд, так и направленные против этого рецептора антитела, в том числе моноклональные. Измерение скоростей биосинтеза и катаболизма данного рецептора позволяет оценить время его обмена в мембране данного типа. На практике прибегают к определению времени полуобмена рецептора, т. е. периода, за который произойдет обновление данного рецептора на клеточной поверхности на 50%. [c.77]

II. Слабоионные детергенты. В присутствии дезоксихолата, по-видимому, происходит наиболее полная солюбилизация мембран, а относительно высокая критическая концентрация мицеллообразования у этого детергента позволяет удалять его с помощью диализа. Кроме того, благодаря малому размеру мицелл связанный детергент не влияет на поведение солюбилизированных белков во время гель-фильтрации. Мы обычно применяем гель-фильтрацию после очистки на колонке с МКА для того, чтобы освободиться от незначительных примесей. Недостаток дезоксихолата заключается в том, что при pH ниже 8, а также в присутствии солей он превращается в гель. Холат, в этом смысле, причиняет меньше хлопот, но он и менее эффективен для солюбилизации. Однако иногда удобно солюбилизировать препарат в дезоксихолате, а после связывания антигена на колонке заменить его холатом. При работе с лимфоидной тканью, если предусматривается солюбилизация солями желчных кислот, необходимо предварительно удалить клеточные ядра. В противном случае высвобожденная ДНК значительно увеличит вязкость раствора. Если же антигены выделяют из мозговой ткани, в которой количество клеточных ядер на единицу веса гораздо меньше, можно сразу проводить экстракцию дезоксихолатом, поскольку в этом случае вязкость экстракта, очевидно, не будет чрезмерной. [c.187]

Так как изучаемые антигены клеточной поверхности представляют собой интегральные гликопротенды плазматической мембраны, нх прежде всего нужно извлечь из мембранного матрикса в растворимой форме. Для этого лучше использовать агенты, не нарушающие антигенную структуру белка. С этой точки зрения для солюбилизации большинства антигенов пригодны вещества с относительно мягким действием — анионный сурфактант дезоксихолат и неионные детергенты. [c.68]

Концентрация рецепторов в клетке крайне низка. Обычно она составляет (0,Д—0,5) 10 i2 молей на 1 мг белка. В клетках крови число -адренергических рецепторов порядка 1000 молекул на клетку. Для получения мембранного рецептора в гомогенном виде необходима очистка в 200—500 тысяч раз. Выделение рецепторов затруднено также тем, что после разрушения клеток, выделения и очистки субклеточных структур рецепторы, локализованные в этих структурах, нельзя тестировать по их биологическим эффектам, так как в большинстве случаев биологический эффект опосредуется согласованной работой многих структур, а подчас и вовсе требует целостности клетки или даже определенного многоклеточного ансамбля. Так, например, после получения очишенной фракции плазматических мембран а-адренергические рецепторы не удается тестировать по повышению проницаемости этих мембран для Са +, так как такие мембраны обычно становятся свободно проницаемыми для всех ионов. Тестировать -адренергические рецепторы по ускорению липолиза нельзя после разрушения жировой ткани ц. выделения мембран. Однако эти мембраны содержат аденилатциклазу, акти--вация которой является первым этапом в процессах ускорения липолиза -адренергическими агонистами. Тестируя - рецепторы по активации аденилатциклазы, можно выделить и очистить плазматическую мембрану, в которой локализованы и -рецепторы и аденилатцик--лаза. Следующим этапом должна быть солюбилизация мембраны детергентами или органйческими раствори- телями, так как практически вс мембранные рецепто- ры — интегральные белки мембраны. После солюбилизации аденилатциклаза сохраняет свою активность, [c.131]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология