Белки специфичное расщепление

Согласно изложенным выше представлениям, аминокислоты, отложившиеся на поверхности шаблона, образуют затем пептидную цепь. Этот процесс является ферментативным, однако нет никаких доказательств того, что в нем принимают участие специфические ферменты, и, следовательно, нет необходимости постулировать наличие таких специфических ферментов. Протеолитические ферменты, выделенные из органов, не являются специфическими, так как они катализируют гидролиз самых различных белков животного и растительного происхождения. Эти же ферменты могут катализировать и процесс синтеза пептидов из аминокислот, что было убедительно показано Бергманом и его сотрудниками [18, 20]. В предыдущих разделах данной главы уже указывалось, что синтез белков нельзя рассматривать просто как процесс, обратный их расщеплению, и что промежуточные реакции синтеза могут протекать иначе, чем соответствующие гидролитические реакции. Наиболее важным моментом является то, что мы не имеем решительно никаких доказательств специфичности ферментов, участвующих как в гидролизе, так и в синтезе белка. Специфичность образующегося белка можно вполне удовлетворительно объяснить специфической адсорбцией аминокислот на поверхности шаблона. [c.410]

В. Контрольный опыт с очищенной ДНК нужен потому, что не все последовательности ДНК одинаково чувствительны к микрококковой нуклеазе. Важно знать чувствительность каждой изучаемой последовательности ДНК. Иначе можно ошибочно полагать, что появление специфической полосы объясняется связыванием белка рядом с участком расщепления, в то время как на самом деле она зависит от специфичности расщепления нуклеазой. В действительности центромера сама по себе-предпочтительный участок разрезания (хотя это не показывают результаты по обработке нуклеазой очищенной ДНК, представленные на рис. 9-9). Тот факт, что в этом чувствительном участке расщепления не происходит, служит еще одним доказательством специфической защищенности этой последовательности. [c.391]

Для расщепления полипептидов и белков использовались и другие ферменты. Однако их действие оказалось недостаточно специфичным, поэтому они не рассматриваются подробно. Для оценки потенциальных возможностей этих ферментов следует указать на некоторые особенности их действия. Несмотря на относительную неспецифичность, эти ферменты исключительно важны для расщепления природных белковых соединений на мелкие осколки с целью получения данных [c.206]

Шредер [278] также сообщает, что в указанных условиях пептиды образуются с низкими выходами. Таким образом, специфичность этого метода не столь велика, как этого можно было бы ожидать на основании данных о выделении свободных аминокислот, и этот метод безусловно непригоден для селективного расщепления белков. [c.227]

Важной для клинической практики является проблема парентерального белкового питания. Как известно, белки пищи могут быть использованы организмом человека только после предварительного переваривания и расщепления их в пищеварительном тракте до свободных аминокислот. Введение белков парентерально, т.е. минуя кишечный тракт, приводит к развитию сенсибилизации (повышенная чувствительность организма к чужеродному белку), а повторное введение белков может вызвать анафилаксию—шоковое состояние. Между тем такой метод введения белка иногда вынуждены использовать, в частности, в хирургической практике при непроходимости пищевода в результате ожогов и отравлений, при тяжелых раковых поражениях пищевода и желудка, после операций на желудке и кишечнике и др. Для предотвращения тяжелых осложнений, возникающих после парентерального введения белковых растворов, в настоящее время для белкового питания используют гидролизаты белков (смесь аминокислот). Введение аминокислотной смеси не вызывает аллергических реакций, поскольку свободные аминокислоты не обладают в отличие от белков ни видовой, ни тканевой специфичностью. Длительные наблюдения больных в клинических условиях свидетельствуют, что потребности организма в белках могут быть полностью компенсированы введением смеси аминокислот. Нельзя не отметить, однако, ряд побочных отрицательных реакций организма в ответ на введение гидролизатов белков, в частности возможность нарушения нормальной психической деятельности. [c.417]

Весь сложный процесс переваривания пищевых белков в пищеварительном тракте настроен таким образом, чтобы путем последовательного действия протеолитических ферментов лишить белки пищи видовой и тканевой специфичности и придать продуктам распада способность всасываться в кровь через стенку кишечника. Примерно 95—97% белков пищи всасывается в виде свободных аминокислот. Следовательно, ферментный аппарат пищеварительного тракта осуществляет поэтапное, строго избирательное расщепление пептидных связей белковой молекулы вплоть до конечных продуктов гидролиза белков —свободных аминокислот. Гидролиз заключается в разрыве пептидных связей —СО—МН— белковой молекулы. [c.418]

Одна из основных стадий расшифровки аминокислотной последовательности состоит в частичном расщеплении молекул исследуемого белка. Используемые для этой цели методы частичного гидролиза или специфического химического расщепления, кроме максимально возможной специфичности, должны отвечать следующим требованиям 1) в ходе реакции аминокислоты не должны разрушаться [c.34]

Для специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как ферментативные, так и химические методы. Из ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипсин и химотрипсин. Трипсин специфично катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных после положительно заряженных аминокислотных остатков лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки после остатков ароматических аминокислот — фенилаланина, тирозина и трипто- [c.269]

В результате расщепления белков в ЖКТ под действием протеолитических ферментов белки теряют свою видовую, тканевую специфичность и всасываются в кровь в тонком кищечнике в виде аминокислот. Всасывание аминокислот, освобождающихся из белков пищи, происходит очень быстро. Известно, например, что через 15 мин после приема меченого К-дрожжевого белка К-аминокислоты обнаруживаются в крови, а их максимальная концентрация достигается через 30—50 мин после приема белка. [c.366]

Для расщепления белков используют также катионо- и анионообменные смолы [40, 125, 177, 182, 190, 191]. По-видимому, наибольшей эффективностью отличается сульфированный полистирол — дауэкс 50, который для ряда белков является более специфичным агентом, чем 1,081 н. HG1 [191]. Относительная скорость гидролиза приблизительно одинакова, но для большинства изученных пептидов дауэкс 50 в 115 раз эффективнее, чем HG1. При изучении энтальпии и энтропии активации гидролиза пептидов при помощи HG1 и дауэкс 50 было найдено, что энтальпии одинаковы, в то время как энтропийный член больше нри гидролизе с помощью дауэкс 50. Это согласуется с наблюдаемой большей эффективностью гидролиза. Были высказаны предварительные соображения относительно механизма гидролиза пептидов [190]. [c.393]

В противоположность кислому и щелочному гидролизу при расщеплении белков с помощью протеолитических ферментов наблюдается относительная специфичность разрыва по определенным пептидным связям. Поэтому обычно используют ряд таких ферментов, которые дают наибольшее число перекрывающихся участков, что позволяет расположить один за другим выделенные фрагменты и таким образом определить структуру белка. Несмотря да многочисленность доступных протеолитических ферментов, [c.394]

Для повышения специфичности расщепления сложноэфирной связи по сравнению со специфичностью кислотного гидролиза Эллиот ацилировал свободные аминогруппы при pH 5. В результате обработки ацилированного белка 0,01 и. щелочью при комнатной температуре в течение 1,5 час значительно увеличивается количество диализуемого азрта, что согласуется с гидролизом эфирной связи с образованием смеси ацетил- или формилсерилпептадов. От этих пептидов ацильные группы были отщеплены обработкой на холоду раствором хлористого водорода в метаноле окисление перйодатом продукта реакции позволило установить, что из общего числа остатков серина в цепи 62% составляют концевые свободные остатки. Описанные выше реакции, которые Эллиот [96] использовал для селективного расщепления Пептидных цепей по остаткам серина и треонина, протекают по следующей схеме [c.219]

Приведенный пример является вполне <благополучным> в том смысле, что нигде не возникает неоднозначностей в принятии решения по объединению пептидов. Нетрудно, однако, убедиться, что если бы, например, в серии С хептидов оказалось два пептида, имеющих на N-конце дипептид ER, то осталось бы неясным, какой из них примыкает к С-концу пептида С-5. Точно так же, что еще более вероятно, если бы в серии Т-пептидов имелось два (или более) пептида, начинающихся с остатка фенилаланина, то осталось бы неясным, какой пептид примыкает к С-концу пептида Т-Ю. Вероятность таких совпадений повышается с ростом размера белка, чему сопутствует рост числа пептидов, образующихся при трипсиновом, химотрипсиновом или каком-либо другом специфичном расщеплении. Как уже говорилось, в этом случае приходится прибегать к большему числу вариантов специфического расщепления цепи. [c.275]

Исследование первичной структуры белка начинается с определения его молекулярной массы, аминокислотного состава, N- и С-кониевых аминокислотных остатков. Поскольку пока не существует метода, позволяющего установить полную первичную структуру белка на целой молекуле, полипептидную цепь подвергают специфичному расщеплению химическими реагентами или протеолитическими ферментами. Смесь образовавшихся пептидных фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность. [c.33]

По участку loxP плазмидная ДНК может быть расщеплена белком Сге фага Р1, по os-участку — соответствующим ферментом фага Я. Такие участки удобны для строго специфичного расщепления гибридных плазмид, мечения полученных концов и последующего рестрикционного картирования клонированных фрагментов изучаемого генома. [c.108]

Таблица 4.2. Специфичность расщепления белков некоторыми эндопротеазами

Одним из наиболее исследованных семейств ферментов являются сери-нопротеазы. Все они предназначены для расщепления полипептидньгх цепей белков по механизму, в котором участвует боковая цепь аминокислоты серина (— Hj—ОН), находящейся в активном центре фермента. Три такие протеазы (трипсин, эластаза и химотрипсин) синтезируются в поджелудочной железе и вьщеляются ею в кишечник, где они превращают содержащиеся в пище белки в аминокислоты, способные всасываться через стенки кишечника. Благодаря возможности легко изолировать эти ферменты и их сравнительно высокой устойчивости их удалось интенсивно исследовать химическими способами еще до того, как стало возможным проведение рентгеноструктурного анализа белков. В настоящее время биохимический и рентгеноструктурный анализы позволили установить достаточно ясную картину функции этих ферментов, иллюстрирующую два аспекта действия любых ферментов каталитический механизм и специфичность к субстрату. [c.318]

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЁНТЫ (протеазы), ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз (протеолиз) пептидных связей. Место расщепления пептидной связи в полипептидной цепи определяется позиционной и субстратной специфичностью фермента и пространств, структурой гидролизуемого субстрата (белка шш пептида). [c.112]

Природные ферменты наиболее близки к идеальным реагентам специфического расщепления белков. Трипсин является-наиболее специфичным в отношении других протеиназ установлены отклонения от специфичности, которой следовало бы ожидать на основании изучения их взаимодействия с син-т ХИч кими субстратами. Однако известно, что трипсин рас-щерляет пептидные связи, в которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, имеющих положительно заряженную боковую цепь. До сих пор не обнаружено [c.165]

В данном разделе специфичность протеолитических ферментов рассматривается применительно к селективному расщеплению полипептидов и белков с известным порядком расположения аминокислот. Следует, однако, иметь в виду, что порядок расположения аминокислотных остатков в цепи не определяет полностью пространственные взаимодействия. При свертывании цепи и появлении, например, структуры а-спи-рали боковые цепи последовательно расположенных аминокислотных остатков выступают из спирали через определенные промежутки и повернуты друг к другу на угол, ра-вный примерно 100° по отношению к оси спирали. Свобода вращения боковых цепей обусловливает значительное разнообразие занимаемых ими положений они могут быть удалены от другой- боковой цепи или пептидной связи, расположенных на расстоянии нескольких аминокислотных остатков в главной цепи, на такое же расстояние, как и от своего аминокислотного остатка или пептидной связи. Кроме того, возможно взаимодействие между боковыми цепями и пептидными связями, расположенными рядом геометрически, но принадлежащими к значительно удаленным друг от друга в цепи аминокислотным остаткам или даже к другой полипептидной цепи молекул. Таким образом, знание пространственной конфигурации может оказаться столь же важным при решении рассматриваемого вопроса, как и знание последовательности расположения аминокислот. [c.179]

Заключение. Действие химотрипсина по отношению к субстратам с длинной пептидной цепью достаточно специфично, что позволяет использовать его для селективного расщепления белков. Если пролильный остаток расположен за аминокислотой с ароматической боковой цепью, то пептидная связь устойчива к гидролизу. [c.206]

Специфический протеолиз — удобный процесс для образования сложных белковых структур. Во многих случаях белки модифицируются путем расщепления одной или нескольких пептидных связей. Для обозначения этого типа катализируемых ферментами реакций, которые играют доминирующую роль во многих физиологических процессах [137—139], используются термины ограниченный протеолиз или специфический протеолиз (табл. 4.2). Хорошо известными примерами специфического расщепления полипептидов являются активация предшественников пищеварительных ферментов, морфогенетические процессы в бактериальных вирусах и каскадные процессы коагуляции и комплементного действия крови [138, 140]. Недавно было показано, что механизмы посттрансля-ционного расщепления имеют место также при образовании таких разных белков, как инсулин, коллаген и специфичные белки вирусов. Кроме того, высокоспецифичное протеолитическое расщепление ферментов важно при инактивации и активации специфических внутриклеточных ферментов (табл. 4.2). [c.72]

Трнпснноподобные сериновые протеазы [138, 536] образуют семейство расщепляющих белки ферментов, которые контролируют многие важнейшие физиологические процессы (табл. 9.4).Пищеварительный фермент трипсин, для которого и был впервые употреблен термин энзим (фермент), является наиболее изученным членом этого семейства. Он известен уже более ста лет, а его способность к расщеплению пептидных связей вблизи лизиновых и аргнннновых остатков очень сходна со свойствами большей части других белков из этого семейства. Однако большинство родственных трипсину ферментов намного более специфичны, чем сам трипсин каждый из них расщепляет в белке только одну или очень небольшое число пептидных связей. Структурная гомология сериновых протеаз была изучена и обобщена Хартли в 1970 г. [490]. Попарныесравнения трипсина,, эластазы, химотрипсина и тромбина показывают, что около 40% их аминокислотных последовательностей идентичны (58 РАМ). На сегодняшний день известны структуры первых трех из этих ферментов. Как и предсказывалось, все они имеют одинаковую укладку цепи [18, 243—245]. [c.216]

Биохимические процессы в клетке контролируются специальными белками -ферментами. Ферменты являются биокатализаторами с очень высокой эффективностью и специфичностью. Они могут увеличивать скорость реакций в 10 и более раз. Очень часто ферменты называют по субстрату с окончанием аза . Так, фермент цел-люлаза катализирует гидролиз целлюлозы. Используются также названия ферментов по катализируемой реакции. Например, гидролазы катализируют гидролиз, дегидрогеназы - отрыв водорода и т.д. В связи с увеличением числа известных ферментов в настоящее время по катализируемым реакциям все ферменты разделены на шесть классов оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы. Ок-сидоредуктазы катализируют обратимые окислительно-восстановительные реакции, в которых происходит перенос водорода, электронов или гидрид-нонов. Трансферазы переносят группы атомов от одного соединения к другому. Гидролазы катализируют гидролитическое расщепление различных связей (гликозидных, пептидных, эфирных и др.). Лиазы катализируют реакции, в которых происходит расщепление химических связей с образованием двойных связей илн присоединение по двойным связям. Изомеразы воздействуют на процессы изомеризации. Л и газы (син-тетазы) катализируют образование связи между двумя соединениями, используя энергию АТФ и других высокоэнергетических соединений. [c.327]

Короткие последовательности с Л/-конца белков часто идентифицируют, используя ферментативную деградацию. Промышленность производит несколько аминопептидаз, отличающихся специфичностью. Лейцинаминопептидаза из почек свиньи, как следует из ее названия, гидролизует преимущественно лейцин и сходные аминокислоты с гидрофобными боковыми группами. Несмотря на то, что скорости расщепления, Л/-концевых аминокислот лежат в широких пределах, гидролиз желательно продолжать до конца, за исключением аминокислоты, предшествующей пролину. Вследствие столь широкого изменения скоростей расщепления следует соблюдать осторожность при интерпретации результатов анализа деградации, катализируемой этим ферментом. Чрезвычайно важно отбирать пробы для анализа в течение деградации. Например, при анализе белка с Л/-концевой последовательностью А1а-Ьеи-Ьеи. .. на ранних стадиях деградации выход аланина превышает выход лизина, однако при большом времени гидролиза соотношение меняется на обратное [24]. Другой фермент, выделенный из почек свиньи, ами-нопептидаза М, гораздо менее специфичен и, по-видимому, более пригоден для расщепления белков. [c.271]

Тиализильная пептидная связь, получающаяся в результате восстановления дисульфидных связей и 5-аминоэтилирования образовавшегося остатка цистеина, также расщепляется трипсином (см. разд. 23.3.3), так как ее боковая группа является изостериче-ской боковой группе Lys. Природа R имеет второстепенное значение, хотя связи Arg-Pro и Lys-Pro не разрываются. Известны и многие другие протеиназы, которые по своей специфичности напоминают трипсин. Например, известно, что тромбин разрывает участки Arg-Gly и Arg-Ser в фибриногене — одном из своих природных субстратов, однако для эффективного катализа необходима еще и связь фермента со вторым участком молекулы субстрата. Поэтому тромбин находит лишь ограниченное применение при расщеплении пептидных связей с целью изучения последовательности, хотя в случае секретина он разрывает связь Arg-Asp, в то время как три связи Arg-Leu остаются незатронутыми. Действие трипсина можно ограничить так, чтобы он разрывал либо по остаткам аргинина, либо по остаткам лизина. Модификация белка малеиновым ангидридом приводит к защищенным е-амино-группам лизиновых остатков схема (27) . [c.275]

Было разработано несколько аффинных меток. Среди них - глутатионтрансфераза, белок, связывающий мальтозу, и короткие аминокислотные последовательности - антигенные детерминанты, которые связываются соответственно с глутатионом, мальтозой и специфическими антителами. Использовали и разные сайты расщепления, специфичные для тромбина, энтерокиназы и других протеиназ. Аффинная метка и сайт расщепления могут находиться как на N-, так и на С-конце рекомбинантного белка и использоваться в прокариотических системах экспрессии, а также в системах экспрессии на основе клеток насекомых, млекопитающих или грибов. [c.149]

Различные бактериальные штаммы продуцируют серологически различные токсины, но все они построены одинаковым образом [16] и образуются из неактивного предшественника (претоксина — белка с М 145 000) посредством протеолитиче-ского расщепления одной из пептидных связей. Получающиеся субъединичные пептиды с М 50 000 и 100 ООО связаны дисуль-фидной связью, восстановительное расщепление которой приводит к потере токсичности [17]. Токсин ботулизма связывается специфично с ганглиозидами, но не с цереброзидами или другими липидами. Прочность связывания возрастает с увеличением числа остатков сиаловых кислот в ганглиозиде (т. е. от Gmi к Gti). Возможно, что токсин может также реагировать с гликопротеинами. Токсин ботулизма in vitro селективно связывается с синаптосомами, а in vivo он блокирует химические синапсы посредством ингибирования пресинаптического высвобождения молекулы медиатора. [c.52]

Миозин представляет собой белок необычного сзроения, состоящий из длинной нитевидной части (хвост) и двух глобулярных головок. Общая длина одной молекулы составляет порядка 1600 нм, из которых на долю головок приходится около 200 нм. Миозин обычно выделяется в виде гексамера, образованного двумя одинаковыми полипептидными цепями с молекулярной массой 200 ООО каждая (так называемые тяжелые цепи) и четырьмя легкими цепями с молекулярной массой около 20 ООО. Тяжелые цепи закручены спиралью одна вокруг другой, образуя хвост, и несут на одном конце глобулярные головки, ассоциированные с легкими цепями. На головках миозина находятся два важных функциональных центра — каталитический центр, способный в определенных условиях осуществлять гидролитическое расщепление /3-7-пирофосфатной связи АТФ, и центр, обеспечивающий способность специфично связываться с другим мышечным белком — актином. [c.435]

Наряду с трипсином из яоджелудочной железы выделяют другую сериновую протеиназу — химотрипсин. Используемый для структурных исследований а-кимотрипсин А проявляет максимальную активность в диапазоне pH 7,8 — 9,0. Химотрипсин обладает гораздо более широкой специфичностью, чем трипсин. Фермент преимущественно катализирует гидролиз пелтидиык связей, образо< ванных карбоксильными группами ароматических аминокислот — тирозина, фенилаланина и триптофана. С меньшей скоростью гидролизуются пептидные связи лейцина, метионина, гистидина. Скорость расщепления отдельных связей в белках и пептидах зависит от характера соседних аминокислотных остатков. [c.45]

Химические методы расщепления. Среди химических методов фрагментации белков наиболее специфичным и чаще всего применяемым является расщепление бромциаиом по остаткам метионина. Метод разработан в 1961 г. Э. Гроссом и Б. Виткопом и по избирательности действия не имеет себе равных. [c.48]

ХИМОТРИПСИН, фермент класса гидролаз, относится к эндопептидазам. Мол. масса бычьего X. 25 300, р1 9, оптим. каталитич. активность при pH 7,5—8,0, состоит из трех цепей, связанных дисульфидными мостиками. По типу каталитяч. центра относится к группе серин-гистидиновых гидролаз. Образуется в поджелудочной железе позвоночных из предшественника (химотрипсиногена) последоват. отщеплением двух дипептидов в середине цепи. Катализирует гидролиз белков, пептидов, эфиров и амидов аминокислот проявляет специфичность к гидрофобным аминокислотам, участвует в расщеплении белков пищи в тонком кишечнике. Ингибируется ионами тяжелых металлов, борорг. к-тами, диизопропилфторфосфатом и др. Избирательно гидролизует белки пораженных тканей. Использ. для лечения тромбозов, ожогов. [c.654]