Константы диссоциации комплекса фермент ингибитор

Константа ингибирования К, при обратимом ингибировании — это константа диссоциации комплекса фермент-ингибитор [c.182]

При анализе действия обратимых ингибиторов мы рассмотрели взаимосвязь между величиной /во и рациональной мерой реакционноспособности этих ингибиторов — константой диссоциации комплекса фермент — ингибитор. При этом было установлено, что величина /бо лишь в случае чисто неконкурентных ингибиторов совпадает с Кг- Уже для конкурентных обратимых ингибиторов при переходе от Ьо к Кг необходим учет величин константы Михаэлиса и концентрации субстрата, поскольку в системе устанавливается равновесие между Е, 3 и I (стр. 87). Что касается необратимых ингибиторов, то в этом случае использование /во для оценки их реакционноспособности без учета времени реакции не имеет никаких оснований. [c.113]

При исследовании обратимых ингибиторов определение зависимости константы ингибитора (константы диссоциации комплекса фермент — ингибитор Кд от температуры позволяет рассчитать А/ , АЯ и А5 для взаимодействия ингибитора с ферментом. При этом используются те же уравнения термодинамики, которые применяются для анализа реакции с субстратом. Таким образом, для реакции образования комплекса Е1 [c.135]

Конкурентное ингибирование проще всего можно распознать экспериментальным путем, определив влияние концентрации ингибитора на зависимость начальной скорости реакции от концентрации Субстрата. Для выяснения вопроса о том, по какому типу-конкурентному или неконкурентному-происходит обратимое ингибирование фермента (дополнение 9-3), весьма удобно преобразовать уравнение Михаэлиса-Ментен в линейную форму. Чаще всего для этой цели используют метод двойных обратных величин. Из графиков, построенных в двойных обратных координатах, можно определить также значение константы диссоциации комплекса фермент-ингибитор. Для реакции диссоциации [c.246]

Константа диссоциации комплекса фермент—ингибитор (i ) выражается уравнением [c.232]

Уо К [ + PjК ) + конкурентное ингибирование продуктом. (2.379) Здесь — константа диссоциации комплекса фермент-ингибитор [c.317]

Ингибиторы, структурно аналогичные субстрату, способны связы- аться с субстрат-связывающим центром. В случае истинного конкурент-.ного ингибирования должна иметь место конкуренция между субстратом и ингибитором за связывание с одним и тем же центром, а кроме того, связывание одного из этих лигандов должно исключать связывание другого. Сродство ингибитора к ферменту количественно выражается константой ингибирования Ki, которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермента с ингибитором Е1 [c.27]

Величину К = [Е] 1] / [ЕТ], которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермента с ингибитором, называют константой ингибирования. Таким образом, при конкурентном ингибировании увеличивается константа Михаэлиса, а максимальная скорость ферментативной реакции остается неизменной. [c.226]

Подход к измерению константы продукта может быть двояким. Продукт реакции вводится заранее в систему фермент — субстрат, после чего измеряется зависимость начальной стационарной скорости реакции в ряду концентраций субстрата и продукта. Этот способ фактически ничем не отличается от способа исследования обычных обратимых ингибиторов. Он позволяет выяснить характер ингибирующего действия продукта реакции, т. е. установить, является ли он конкурентным, неконкурентным или смешанным, и измерить константу диссоциации комплекса фермент -г- продукт. [c.99]

ТОГО, если данный комплекс важен при катализе, то константы диссоциации, измеренные при изучении связывания, должны приближаться к константам, определенным при изучении начальной скорости реакции в целом, хотя различие в используемых концентрациях белка может вызвать в некоторых случаях трудности при интерпретации. Необходимые константы могут быть получены из изучения начальной скорости для иона металла Ка) и для лиганда, если он является ингибитором Кг). Однако константы диссоциации комплексов фермент — субстрат и фермент — продукт не так легко получить, пока не сделаны допущения относительно скоростьопределяющей стадии реакции и (или) порядка присоединения субстрата (или отщепления продукта). Следовательно, утверждение о кинетической важности таких комплексов, наиболее интересных с точки зрения изучения механизма действия металлоферментов, связано с большими сложностями. [c.450]

В случае фермента химотрипсина в качестве конкурентных ингибиторов часто выступают оптические антиподы асимметрических субстратов. Разница между оптическими изомерами подразумевает взаимодействие между ферментом и субстратом в трех точках, как это изображено схематически на рис. 123, на котором группы Р и р субстрата присоединены к поверхности молекулы фермента группами А и В, а па чувствительную связь К воздействует группа С. В случае оптического антипода субстрата взаимодействующие группы Р и Q точно так же могут быть соединены с группами А и В, однако группа В теперь слишком далеко удалена от воздействующей на нее функциональной группы С. Согласно этой модели, можно было ожидать, что константы диссоциации комплексов фермент-субстрат и фермент-ингибитор почти одинаковы. Поскольку экспериментально доказано, что константы диссоциации многих комплексов фермент-ингибитор соответствуют значениям субстрата, в этом случае можно [c.326]

Именно при изучении влияния микроокружения на специфические взаимодействия важную роль начинает играть метод аффинной хроматографии. Как подробно показано в гл. 4, возможно, напри.мер, использовать колонку с иммобилизованным ингибитором н вытеснять специфически сорбируемый фермент растворами его ингибиторов в различных концентрациях. Па основе объемов элюата могут быть рассчитаны константы диссоциации фермента как со связанным, так и с растворенным ингибитором. Если использовать тот же ингибитор для связывания на нерастворимой подложке и для элюирования специфически сорбированного фермента, то информацию о влиянии окружения на образование комплекса можно получить, основываясь на различиях, если таковые имеются, в величинах определяемых констант диссоциации. Поскольку специфические взаимодействия играют очень важную роль в большинстве процессов, протекающих в природе, разработка простого метода определения констант диссоциации комплексов несомненно имеет важное значение. [c.12]

К1—константа равновесия диссоциации комплекса фермент— растворимый ингибитор [c.35]

При таком механизме процесса ингибирующее влияние продуктов реакции может рассматриваться как частный случай действия конкурентных обратимых ингибиторов. Следовательно, и количественная оценка ингибирующего действия продуктов реакции может быть дана на основе измерения константы диссоциации комплекса продукт — фермент (ее можно, по аналогии с константой ингибитора назвать константой продукта). Не исключено, однако, что продукт ферментативной реакции имеет возможность взаимодействовать, помимо того, с функциональными группами вне активного центра и, таким образом, влиять на активность фермента по принципу неконкурентного ингибитора. [c.99]

Взаимодействие между трипсином и овомукоидом в отсутствие субстрата фермента протекает слишком быстро, поэтому непосредственные измерения сделать нельзя, но константа диссоциации комплекса была измерена и равна приблизительно 5-10 М. В том случае, если карбоксильные группы овомукоида блокированы этерификацией или аминогруппы трипсина ацетилированы, образование комплекса резко замедляется [62—64]. Диссоциация комплекса на его компоненты при значениях pH ниже 3 [65, 61] должна наводить на мысль, что ионизация карбоксильных групп фермента или ингибитора или обоих компонентов является основным условием для [c.36]

Использование аффинной хроматографии для определения, например, констант ингибирования ферментов, по-видимому, весьма перспективно. Данные об объемах элюатов, содержащих фермент, на колонке с иммобилизованным ингибитором, полученные при использовании различных концентраций ингибитора в растворе, позволяют определить константы ингибирования как для связанного ингибитора, так и для ингибитора в растворе. Метод детально рассмотрен в гл. 4. Большое преимущество этого метода состоит в том, что при использовании одного и того же ингибитора как для иммобилизации, так и для элюирования можно непосредственно сделать выводы о влиянии связей с носителем и природы носителя на изучаемое взаимодействие на основании совпадения или различий в определяемых величинах констант диссоциации. Следовательно, метод аффинной хроматографии открывает новые возможности не только для изучения взаимодействия биологически активных веществ, он перспективен также и для выяснения влияния микроокружения на образование этих комплексов. [c.19]

Самый распространенный тип ингибирования назван конкурентным ингибированием, поскольку наиболее простое объяснение этого типа ингибирования сводится к тому, что ингибитор связывается с тем же самым центром молекулы фермента, что и субстрат, с образованием непродуктивного комплекса. Другими словами, субстрат и ингибитор конкурируют за один и тот же центр связывания и, следовательно, может образоваться только один комплекс фермента с ингибитором — Е1. В простейшем случае конкурентного ингибирования Е1 представляет собой тупиковый комплекс, поскольку распадается он только в результате диссоциации на исходные компоненты (Е Ч- I). Поэтому концентрация комплекса Е1 определяется истинной константой равновесия = [Е1[11/[ЕЦ (см. разд. 3.7), которую называют константой ингибирования. Для многих более сложных типов ингибирования, включая и большинство типов ингибирования продуктом реакции, константу ингибирования нельзя рассматривать как истинную константу равновесия, потому что комплекс фермента с ингибитором не является тупиковым . [c.80]

В работе [8] было показано, что а-кетоглутарат является конкурентным ингибитором реакции окисления Ы-метил-Ь-глутама-та, катализируемого Ы-метилглутамат-дегидрогеназой. Определить константу диссоциации комплекса фермент-ингибитор, исходя из данных табл. 9. [c.89]

В этом случае зависимость в координатах Лайнувера—Берка имеет вид пучка прямых, пересекающихся в точке на оси ординат (табл. 2.5). В этом уравнении К1 — константа конкурентного ингибирования, т. е. константа диссоциации комплекса фермент — ингибитор (Е1) которая отражает срод- [c.115]

Расчеты показали, что холинэстераза имеет в активном центре одну анионную группировку (заряд = —1), а ацетилхолинэстераза — две (заряд = —2). Однако исследованиями Шукудза и Шинода [122] установлено, что действие, например, тетраэтиламмония на оба типа холинэстераз характеризуются близкими кинетическими и термодинамическими константами. Так, значения рК/ для холинэстеразы сыворотки крови и эритроцитов равны 3,88 и 3,91, а теплота диссоциации комплексов фермент-ингибитор—6,0 и 6,5 ккал моль. На основании полученных данных авторы приходят к выводу [c.194]

Томас [97, 98] и Рафтери с сотр. [99—102] наблюдали уширение линий и изменение химических сдвигов сигналов метильных групп ацетамидных фрагментов этих ингибиторов и субстратов в присутствии лизоцима. Рафтери и сотр. изучили взаимодействие АГА, (АГА) 2, (АГА)з и (АГА) 4, а также а- и Р-метилглюкозидов с лизоцимом. Устанавливается равновесие Е+5 Е5, где Е и 5 — фермент и субстрат (ингибитор) соответственно, а Е8 — образованный ими комплекс. Константы диссоциации комплексов /Сз известны. Считается, что обмен свободных и связанных молекул происходит достаточно быстро. Поэтому наблюдаемый сигнал является усредненным. Его положение и полуширина — это средневзвешенные значения химических сдвигов и полуширин линий для обоих окружений в соответствии с молярным соотношением субстрат/фермент, которое всегда было не меньше 4. Однако в некоторых случаях приближение быстрого обмена не выполняется. Обмен оказывается слишком медленным, и его скорость зависит от pH и температуры. В частности, примечательно, что при медленном обмене сигнал ацетамидо-группы сильно уширен за счет не связанного с молекулярным движением вклада в кажущееся значение Тг. [c.389]

В этой связи особый интерес представляет работа Фрица, Траучолда и Верле [69] по исследованию различных ингибиторов протеаз. Сначала на сефадексе Q-50 определяли молекулярный вес нескольких новых ингибиторов. При хроматографировании на сефадексе G-75 комплекс (1 1) трипсина (мол. вес 24 000) и его ингибитора (мол. вес 6500) элюируется в объеме, соответствующем молекулярному весу 26 ООО (вместо предполагаемого 30 500). Авторы объясняют это тем, что комплекс имеет, вероятно, очень компактную структуру (полагая при этом, что ингибитор частично внедряется в молекулу трипсина). Не связанный ингибитор отделяют от смеси комплекса и протеазы на колонке с сефадексом G-50. Авторы определили отдельные компоненты и таким путем нашли константу диссоциации комплекса в различных условиях. Размывания зон, вызываемого сопутствующей диссоциацией, в данном случае не наблюдалось. Аналогичным образом Ауричио [106] доказал образование комплекса фермент — субстрат. Например, трипсин в присутствии казеина элюируется на G-100 гораздо раньше ( мол. вес 100 000), чем в отсутствие субстрата. В то же время казеин не влияет на движение по колонке других белков. [c.178]

Для более полного объяснения кривых элюирования ферментов растворами высокомолекулярных ингибиторов Туркова и др. [15] определили константы диссоциации комплекса химотрипсина с антилизином по методу Данна и Чейкена [7]. Антилизин — поли- [c.49]

Е. — белок, мол. в. 63 700 обладает ферментативной активностью только в присутствии ионов Mg2+, Мп +, Zn + и Fe-+, с к-рыми Е. образует метали-ферментные комплексы в соотношении атом металла на 1 молекулу фермента. Наиболее сильным активирующим действием обладает к-рый, по-видимому, и является ионом, активирующим Е, в фнгзиологич. условиях. Константа диссоциации комплекса Mg-фермент 0,61 прирН 7,34. Са + и Sr + образуют с Е. неактивные комплексы, в связи с чем они конкурентно тормозят ее активность. Конкурентное торможение Е. вызывают также ионы F действие последних проявляется только в присутствии ионов Mg + и фосфата, так что истинным ингибитором в этом случае, по-видимому, является комплекс Mg + F — фосфат. [c.613]

Экспериментально определяемые константы скорости диссоциации комплексов фермент-продукт (или фермент-ингибитор) составляют 1-Ю с , что на три-четыре юрядка выше необходимых для транспептидации. Таким образсм, обычный комплекс фермент-продукт не может быть тем комплексом, ко горы участвует в реакции переноса фрагмента субстрата на акцептор. [c.339]

Ингибиторы ферментативных каталитических реакций часта подразделяют на обратимо и необратимо действующие. Эта классификация основана на легкости отделения ингибитора от фермента при помощи физического метода типа диализа. Так, например, эзерин описан как обратимый ингибитор, в то время как фюсфор-содержащие соединения подобно диизопропилфосфофториду (ВРР) принадлежат к необратимым ингибиторам холинэстеразы. Однако, поскольку рассматриваются механизмы ингибирования, эта классификация только вносит неопределенность, так как из нее вытекает, что обратимые и необратимые ингибиторы действуют различным образом в действительности оба типа ингибиторов действуют, соединяясь с ферментом с образованием неактивных комплексов, обладающих весьма различными константами диссоциации . Необратимые ингибиторы образуют комплексы с очень малыми константами диссоциации и поэтому удаляются из комплекса путем диализа только очень медленно, тогда как обратимые ингибиторы образуют комплексы с высокими константами диссоциации и поэтому на всех стадиях удаления присутствует избыток несвязанного ингибитора, поддающегося диализу. Однако более полезным оказывается подразделение ингибиторов на конкурентные и неконкурентные (хотя многие ингибиторы обнаруживают смешанное поведение), так как эти ингибиторы действуют различными путями и кинетические уравнения для них разные. При конкурентном торможении ингибитор соединяется с тем же самым [c.121]

Против уравнений, выведенных Данном и Чейкеном [6], Николь и др. [12] высказали возражения. Данн и Чейкен [7] ограничились случаями, когда [Е]//Сь мало, т. е. используется очень низкая концентрация фермента. Другое ограничение касается взаимодействий со слишком низкими Кь- Например, если константа связывания равна 10 моль/л, то рассчитанная константа скорости диссоциации комплекса ЕЬ должна быть очень мала ( 0,042 С ) [7]. Следовательно, элюирование белка должно зависеть от кинетических факторов и не может быть проведено за реальное время опыта. Добавление растворимого лиганда к раствору элюента не должно оказывать влияния на элюирование белка, поскольку диссоциация — мономолекулярный процесс. Такими кинетическими эффектами объясняются наблюдаемые иногда неудачи при элюировании некоторых ферментов с аффинных сорбентов буферными растворами, содержащими сильные ингибиторы. В некоторых случаях белковый ник настолько уширяется, что его нельзя обнаружить. Метод пригоден главным образом для случаев, когда доступны сорбенты, содержащие лиганды со средней силой связывания. В таких случаях система полностью обратима в пределах времени проведения хроматографического опыта. [c.49]

В качестве аффинных лигандов можно использовать любые соединения, прочно, специфично и обратимо связывающиеся с выделяемым веществом. Химическое строение аффинных лигандов может быть самым различным. Поскольку в настоящее время метод аффинной хроматографии применяется главным образом для выделения ферментов и их ингибиторов [89J, мы рассмотрим примеры, взятые из этой области. Как уже упоминалось, при выделении фермента аффинными лигандам1И могут служить его ингибитор, аналогичный субстрату, а также эффектор, кофактор и в отдельных случаях даже субстрат. Это справедливо и для фермента, требующего длл реакции два субстрата, но способного достаточно сильно связываться только с одним из них. Субстрат также можно использовать для адсорбции фермента в таких условиях, когда фермент связывается, но сам не способен катализировать реакцию (например, в отсутствие ионов металлов, необходимых для реакции), а также когда константа Михаэлиса зависит от pH или температуры. Аффинный адсорбент для выделения белков обычно трудно получить из аффинного лиганда, если константа диссоциации его комплекса с белком превышает (0,5—1,0)-Ю [16]. Однако Стире и сотр. [84] показали, что очень эффективный адсорбент для р-галактозидазы можно получить даже из такого относительно слабого ингибитора, как н-аминофенил-р-о-тиогалактопирано-зид (/i , 5-10 ). Этого удается достигнуть, повышая концентрацию нерастворимого аффинного лиганда и увеличивая расстояние между аффинным лигандом и матрицей носителя, что приводит к максимальной доступности аффинного лиганда, для белка в растворе. [c.9]

Карбоангидраза быка образует сильно флуоресцирующий комплекс с 5-диметиламинопафталии-1-сульфамидом (ДНСА) [103]. Исследуя усиление флуоресценции лиганда и тушение ультрафиолетовой белковой флуоресценции, Чен и Кернохан [103] показали, что с одной молекулой фермента овязывается одна молекула флуоресцирующего сульфамида. Константа диссоциации этогО комплекса равна 2,5-10 М. Флуоресценция свободного сульфамида имеет пик испускания при 580 нм и квантовый выход 0,055. Соответствующие значения для связанного ингибитора — 468 нм и 0,84. Большое смещение максимума испускания в коротковолновую область можно объяснить сильной гидрофобной природой центра связывания, а также отрывом одного протона от сульфамидной /группы лиганда при присоединении к ферменту [103]. [c.599]

Смотреть страницы где упоминается термин Константы диссоциации комплекса фермент ингибитор: [c.259] [c.238] [c.427] [c.261] [c.116] [c.52] [c.283] [c.442] [c.36] [c.45] [c.90] [c.418] [c.39] [c.212] [c.64] [c.80] [c.477] [c.326] [c.326] [c.231]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология