Высеваемые клетки

Рис. 4.14. Иммунологический скрининг геномной библиотеки (иммунологическое тестирование колоний). Клетки после транстформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроиеллю-лозный или найлоновый фильтр) так, чтобы их расположение в точности соответствовало таковому на чашке.

Рис. 4.13. Скрининг библиотеки геномной ДНК с применением меченого зонда. Клетки после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. 1. Переносят клетки из каждой выросшей колонии на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или найлоновый фильр) так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чащке. 2. Клетки лизируют, высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и депротеинизации и фиксируют на фильтре. 3. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят радиоавтографию с тем чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. 4. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из них материал и культивируют.

Перенос генетического материала путем прямого контакта между двумя клетками называется конъюгацией. Уже давно на основании морфологических данных предполагали, что и у бактерий может происходить своего рода спаривание однако только эксперименты с множественными мутантами бесспорно доказали, что и у бактерий возможна передача генетического материала при прямом межклеточном контакте. В 1946 г. Ледерберг и Татум провели решающий опыт с двумя мутантами Е. соИ К12, каждый из которых был ауксотрофным по двум различным аминокислотам (рис. 15.14). Один двойной мутант нуждался в аминокислотах А и В, но был способен синтезировать С и D (А В D ) другой мутант был ему комплементарен (А В" С D ). Эти мутанты не росли на минимальной питательной среде и не образовывали колоний. Однако если на ту же минимальную среду высевали смесь суспензий обоих мутантов, то колонии появлялись. Клетки этих колоний обладали наследственной способностью синтезировать все аминокислоты, т.е. принадлежали к типу A B D (были прото-трофными). Такие клетки возникали с частотой 1 10 это были генетические рекомбинанты-они объединяли в себе генетическую информацию двух реципрокно дефектных (взаимодополняющих) родительских клеток. Использование в качестве исходных штаммов множественных мутантов исключало возможность появления ревертантов, так как вероятность одновременной реверсии по двум генам составляет величину порядка 10 на генерацию. Необходимой предпосылкой рекомбинации служил прямой контакт родительских клеток. [c.456]

Электропорация. Этот метод основан на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. Для растительных протопластов процедура электропорации оказалась очень эффективной. Метод состоит в следующем на растительные протопласты, находящиеся в растворе большой концентрации, содержащем ДНК-векторы, действуют высоковольтным импульсом (напряжение 200—350 В, длительность импульса 54 мс). В результате молекулы ДНК поглощаются клетками через поры в клеточной мембране. После разведения раствора протопласты высеваются на соответствующую среду для регенерации. Эффективность переноса определяется через 24—48 ч после электрошока. [c.61]

Скрининг библиотек геномных ДНК обычно проводят по следующей схеме. После трансформации высевают клетки на чашки с питательной [c.67]

В чашку Петри на питательную среду высевают клетки животного, взятые, например, из печени, хряща или любой другой ткани или органа. Клетки прилипают к поверхности стекла и начинают расти и делиться. Наконец их становится так много, что они образуют сплошной монослой, и рост прекращается. Остановка роста вызвана, вероятно, не теми причинами, которые были упомянуты выше. А именно [c.96]

В практической работе клетки рассевают в двух разных концентрациях при одной плотности посева получают примерно ожидаемое число колоний контрольных клеток и клеток, обработанных низкими дозами лекарства, при второй высевают клетки, обработанные высокими дозами лекарства. В среднем диапазоне концентраций лекарственного вещества должно быть некоторое перекрывание наборов чашек, и положение этого перекрывающего диапазона подсказывается обычно опытом исследователя. [c.282]

Метод с применением пенициллина или аналогичный ему клетки высевают на среду, лишенную соответствующего фактора роста и содержащую пенициллин или иной агент, оказывающий бактерицидное действие только на растущие клетки [c.452]

Дрожжевые клетки после смыва с агарового косяка помещали на сутки в раствор ванилина на стерильной водопроводной воде (0,01 %) Затем клетки промывали Водопроводной водой и облучали в бюксах при помешивании магнитной мешалкой (1 мл суспензии, 10 клеток лампа БУВ-15 расстояние от лампы 100 мм время облучения 4—10 мин.). После облучения клетки высевали на чашки Петри с 2%-ным сусло-агаром, а подсчет колоний проводили на третьи сутки (опыты ставили при комнатной температуре — 24° модификации в вариантах приводятся в тексте). [c.389]

Концентрация НГ составляла 10, 20, 50 и 100 y/мл, длительность обработки — 10, 20 и 30 мин. нри комнатной температуре. Обработанные и контрольные клетки после соответствующих разведений высевали на МПА и инкубировали при 37° в течение 24 час. [c.49]

Для наблюдения трансформации после первых классических работ, относящихся к передаче признака образования капсул пневмококками, были применены гораздо более удобные для количественного изучения генетические маркеры. Сюда относилась резистентность к разным ядам — стрептомицину, эритромицину, новобиоцину, сульфаниламидам далее — способность использовать различные источники углерода (мальтозу, лактозу, маннит) и т. д. Особенно проста постановка эксперимента по передаче резистентности к яду. Культура клеток, подвергшихся трансформации, попросту высевается на среду, содержащую яд. Все исходные клетки гибнут, а трансформированные растут и размножаются. Следовательно, селекция проводится на нулевом фоне, и метод весьма чувствителен. [c.344]

Количественная оценка роста микроорганизмов требует определения числа клеток в конкретный момент. Все эти методы подразделяют на прямые и косвенные. Прямые методы предполагают непосредственный подсчет клеток под микроскопом — в счетных камерах или на фиксированных мазках. При этом подсчитываются и живые, и мертвые клетки, к тому же такой подсчет возможен только для достаточно крупных микроорганизмов, не образующих агрегаты. К косвенным методам относятся высевы на твердые питательные среды, осаждение на мембранных фильтрах, определение параметров, пропорционально зависящих от количества клеток (биомасса, высушенная на фильтрах постоянной массы, мутность суспензии, общий азот, белок, поглощение кислорода и выделение углекислоты). Следует помнить, что нет универсального метода, лишенного недостатков. Любой метод имеет свои ограничения. Например, не все клетки способны дать колонии на твердой среде, нет питательной среды, подходящей для всех без исключения микроорганизмов, и т.д. [c.75]

Методы прямого прижизненного окрашивания различных проб воды, почвы и осадков позволяют выделять гораздо больше живых клеток, чем высевы на различные среды. Большое расхождение в результатах прямого счета в сравнении с высевом на среды поставило вопрос прижизненно окрашенные микроорганизмы являются живыми или мертвыми Применение в качестве прижизненного красителя акридинового оранжевого показало, что часть клеток окрашивается с последующей зеленой флуоресценцией, часть — остается оранжевой. Это привело вначале к неверному выводу о том, что зеленые клетки — живые, а оранжевые — мертвые. Впоследствии было выяснено, что цвет флуоресценции зависит от отношения ДНК/белок в клетке, в результате активно делящиеся клетки выглядят зелеными, а растущие более медленно или покоящиеся клетки дают оранжевую флуоресценцию, оставаясь при этом живыми. [c.245]

Если клетки, которые собираются высевать, находятся в жидкости, например в воде, молоке или бульоне, то для переноса пробы в пробирку с питательной средой используют проволочную петлю. Петлю погружают в среду и мягко взбалтывают ее. Не забывайте прокаливать горлышко флакона, если снимаете крышку или удаляйте ватную пробку. [c.50]

Второй критерий, определяющий ценность отдельной мутации —это степень инактивации гена, в котором произошла мутация. Частичное сохранение функции часто встречается в случае мутации с заменой оснований и значительно реже при сдвигах рамки или делециях. Степень полноты мутации легко оценить по скорости роста или другим проявлениям свойств, высевая клетки мутанта с низкой плотностью на селективную или непермис-сивную среду. Неполнота мутации может стать проблемой в работе с мутантами, которые должны использоваться в других физиологических экспериментах, связанных, например, с исследованием активности ферментов, или в сопряженных с другими мутантами тест-системах. [c.42]

Лигируйте приблизительно 0,1 мкг очищенной, обработанной фосфатазой ДНК плазмиды pUR с эквимолярным количеством очищенной встраиваемой ДНК в объеме реакционной смеси 10 мкл. Используйте полученную после лигирования смесь для трансформации подходящего для этой цели штамма 71-18 Е.соИ [15], высевая клетки на чашки с 1XYT (8 г трип-тона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г Na l, 15 г агара на 1 л), содержащие 50 мкг/мл ампициллина. [c.144]

Контрольные чашки необходимы, поскольку они позволяют быстро оценить возможность комплементации. Высевая клетки без фага, определяют количество ревертантов в препарате клеток. В разных препаратах может содержаться разное количество ревертантов. Высевая фаг без клеток, определяют содержание в препарате фага клеток, способных расти на минимальных чашках. Высев различных количеств гибридного фага позволяет быстро выявить наличие комплементации, так как число истинных комплементаций должно быть пропорционально количеству гибридного фага. Обычно пул гибридов из Salmonella дает около 10 комплементирующих колоний на чашку. [c.107]

Через 2 дня приготовляют вторую культуру, высевая клетки из первой культуры на 100 мл среды в 0,5-литровой колбе Эр-ленмейера. [c.94]

В тех случаях, если наличие клубеньковых бактерий в почве не удается выявить ни одним из указанных методов, следует применять метод Емцева, Шильниковой, Агаджанян (1964), являющийся комбинацией методов Вильсона и Быстрого. Сущность метода заключается в следующем на чашки Петри со средой Быстрого с кристаллическим фиолетовым высевается почва в разведениях от I 10 до 1 100 000 с поверхности среды стерильной водой смываются выросшие колонии бактерий полученными суспензиями бактеризуются семена. Метод дает возможность обогащения суспензии клетками клубеньковых бактерий при некотором подавлении кристаллическим фиолетовым сопутствующей микрофлоры. Метод дает значительное увеличение количества клубеньков по сравнению с заражением семян соответствующими необогащенными суспензиями. [c.184]

Неспецифическая трансдукция. Перенос участков бактериальной хромосомы фагами был открыт в 1951 г. Ледербергом и Циндером у Salmonella typhimurium. В решающем эксперименте (рис. 15.19) штамм-донор В " инфицировали умеренным бактериофагом Р22. После лизиса клетки-хозяина выделяли свободные фаги и инкубировали их вместе со штаммом-реципиентом В , который генетически отличался от штамма B" по меньшей мере одним признаком. Авторы нашли, что после высева инкубированных клеток на подходящую среду появлялись рекомбинанты, обладавшие признаками штамма-донора В . [c.465]

Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым к регламентам инструкциям. В заводской или цеховой лаборатории должна быть подготовлена культура для последующей наработки инокулюма (инокулята), или посевного материала. В этих целях исходный штамм микроорганизма, сохраняемый в условиях, близких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной сушки), оживляют после добавления стерильной жидкой питательной среды с последующим высевом на уплотненную питательную среду. Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чистой, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить родственные связи), операции по пересеву штамма на среду возрастающих объемов (площади) повторяют несколько раз и проводягг в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам, помещаемым на качалочные устройства (шюттель-аппараты). [c.382]

Рис. 4.11. Определение скрытого периода и урожая фага (на примере экспериментов с размножением фага Т2 в клетках Es heri hia oli В). Молодую культуру бактерий заражали суспензией фага, а затем свободные (не адсорбировавшиеся) фаговые частицы инактивировали добавлением антифаговой сыворотки. После сильного разведения через определенные интервалы времени брали пробы и высевали на агар вместе с избытком бактерий, чувствительных к данному фагу. ]В течение 25 мин число бляшкообразующих единиц оставалось неизменно равным 5 (скрытый период), а затем возрастало до 235 (плато). Согласно этим данным, выход фага на одну инфицированную клетку бактерии (урожай фага) составлял в среднем 47 частиц.

После воздействия, индуцирующего мутации, и многочасового роста бактериальную суспензию инкубируют в среде с глюкозой, но без азота. Это делается для того, чтобы дать возможность клеткам использовать оставшиеся растворимые соединения азота. Через несколько часов добавляют пенициллин и сульфат аммония и проводят инкубацию (на этот раз продолжительностью до 24 ч.). Прототрофные родительские клетки растут, и пенициллин их убивает, тогда как ауксотрофные мутанты, нуждающиеся в определенной аминокислоте, не растут, и это позволяет им уцелеть. Затем суспензию освобождают от пенициллина промыванием или добавлением пенициллиназы и высевают на агаризованную среду, содержащую аминокислоты. Среди вырастающих в таких условиях бактерий процент ауксотрофных клеток оказывается более высоким (помимо них растут также прототрофные клетки, выдержавшие обработку пенициллином). Если бактерии устойчивы к пенициллину, то с той же целью можно применить другие антибиотики (новобиоцин, циклосерин, колистин, канамицин). Для избирательного уничтожения растущих клеток используют и такое явление, как летальный синтез . [c.451]

Другую часть семян после обработки мутагенами высевали в поле. У растений Mi сорта Диамант молодые колосья были зафиксированы в фиксаторе Ньюкомера. Пыльники окрашивали по Фельгену и на давленых препаратах просматривали и анализировали под микроскопом стадии мейоза в материнских клетках пыльцы от профазы I до образования тетрад микроспор. Учитывали нарушения конъюгации хромосом, подсчитывали число уни-и мультивалентов в метафазе I, число мостов, фрагментов и отставших хромосом в анафазах I и II делений, число нормальных тетрад, тетрад с микроядрами. [c.77]

Некоторые культуры дрожжей (Кр-9, Л-2, СД-5) рода andida размножаются в виде сильно разросшихся пучков или веточек, состоящих из большого числа клеток. При разбавлении пробы водой они не распадаются на отдельные клетки, поэтому колонии таких дрожжей вырастают на агаре не из одной клетки, как другие, а из нескольких клеток. При определении степени зараженности по относительному количеству колоний в этом случае можно сделать ошибку. Если высев на сусло-агар показал наличие в дрожжерастильных чанах посторонних дрожжей или грибов, то их выделяют из колоний высевая на солодовое сусло или повторяя высев на сусло-агар, и проводят с ними специальные исследования. [c.195]

Затем на бульон высевали чувствительную к стрептомицину культуру пневмококков, которую после 3 ч инкубации при 37° С охлаждали до 25° С. Ее выдерживали при такой температуре в течение 20 мин. При этом клеточное деление останавливалось на одной и той же фазе митотического цикла. Далее в культуру вводили ДНК, выделенную из устойчивого к стрептомицину штамма, и давали возможность бактериальным клеткам взаимодействовать с ней в течение 5 мин. Затем всю внеклеточную ДНК, не принимавшую участия во взаимодействии с клетками пневмококков, разрушали ДНК-азой, а инкубацию продолжали еще 2 ч. Примерно через 45 мин появлялись устойчивые к стрептомицину клетки пневмококков. Для них было характерно значительно более медленное деление, и в течение нескольких поколений новая ДНК переносилась лишь в одну дочернюю клетку. Наконец одна из таких клеток начинала редуплицировать свою ДНК, после чего она поступала в обе дочерние клетки, которые тоже обладали способностью ее редуплицировать. [c.85]

Одна-единственная фаговая частица, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК, может менее чем за один день образовать более 10 идентичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки Е. соИ, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашках Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со временем образуя видимые колонии. При этом появляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтезируются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают миллиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейщее клонирование, нужно провести отбор трансформированных бактерий. [c.223]

Смотреть страницы где упоминается термин Высеваемые клетки: [c.60] [c.364] [c.38] [c.154] [c.283] [c.192] [c.60] [c.61] [c.68] [c.69] [c.92] [c.139] [c.186] [c.258] [c.380] [c.577] [c.100] [c.209] [c.457] [c.160] [c.263] [c.42] [c.214] [c.118]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология