Источники ДНК для клонирования

Источник клонированного фрагмента ДНК [c.243]

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

Получение растений, устойчивых к гербицидам, методами генной инженерии прежде всего основывается на изучении молекулярных механизмов толерантности и включает следующие этапы выявление мишеней действия гербицидов в клетке растений, отбор растений/бактерий, устойчивых к данному гербициду (в качестве источника генов резистентности), идентификация и клонирование этих генов, изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях. [c.74]

Третий источник молекул ДНК для клонирования — химический, вернее, химико-ферментативный синтез генов. В настоящее время методы синтеза нуклеотидов успешно развиваются. Ил- [c.137]

Какой ИСТОЧНИК ДНК использовать Для оптимальной реализации библиотеки при наличии самых разнообразных стартовых зондов было бы предпочтительнее использовать источник ДНК, представляющей весь геном организма, например периферические лимфоциты донорской крови в случае геномных библиотек человека. Если же предполагается исследование специфической хромосомы, лучше работать с гибридными соматическими клетками, содержащими именно эту хромосому на известном фоне хромосом других видов. Преимущество такой стратегии в том, что она позволяет сразу определить принципиальную ценность клона, полученного при помощи имеющейся библиотеки, путем простой проверки клонированного фрагмента на его принадлежность интересующей хромосоме [17]. [c.101]

Цель данной главы заключается в том, чтобы дать некоторые простейшие указания, как осуществить инсерцию рестрикционного фрагмента ДНК в вектор для трансформации растений, и посвятить исследователя в основы технологии рекомбинантных ДНК. За более детальным разъяснением принципов клонирования генов и анализа последовательностей ДНК следует обратиться к литературным источникам, например [11, 39]. [c.35]

После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и анализируют с помощью авторадиографии с использованием чувствительной к радиоактивному излучению рентгеновской пленки. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения исследования идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот. [c.163]

Таким образом, сочетание методов молекулярной биологии и классической генетики при анализе YA -клонотек, содержащих ДНК из разных источников, дало возможность количественно оценить вероятность нарушения аутентичности клонированной ДНК (Арман и др., 1999). [c.76]

Истинный энзимолог редко интересуется проблемой сырья единственное, что ему нужно, — это выделить как можно больше фермента из наиболее удобного источника. В этом случае необходимо изучить литературу и выбрать лучший объект, с которым можно работать. При сравнении результатов, полученных в разных лабораториях, порой стоит самому провести несколько экспериментальных измерений. Очень важно убедиться в том, что фермент, присутствующий в исходном материале, экстрагируется из него полностью, для того чтобы можно было достоверно определить его содержание в ткани. При неполном разрушении клеток можно недооценить данный объект как источник ферментов из-за того, что значительная часть ферментативной активности не выходит в раствор, а удаляется вместе с осадком во время получения экстракта. Если фермент выделяют из бактериального. материала, то экспериментатор должен учитывать возможность отбора штаммов с аномально высоким уровнем ферментативной активности. Это можно сделать либо путем обычного отбора мутантов, либо используя более сложную технику клонирования, посредством которой множественные копии гена фермента включаются в бактериальный геном с помощью плазмид [1]. Экспрессия гена. может быть еще более усилена за счет его слияния с сильным промотором [2]. Эта работа занимает много времени, и выполнить ее может только опытный специалист не стоит даже пытаться применять эти методы, если на выделение фермента отведено мало времени. [c.37]

После успешного клонирования генов интерферона и их экспрессии в бактериях [138, 200] несколько компаний начали производство препарата в коммерческих масштабах. a-2-Интер-ферон проверяется в клинике с 1981 г., и с увеличением доступности этого препарата быстро накапливается связанный с ним клинический опыт. Рекомбинантные препараты состоят из молекул только одного вида, и их клинический эффект может отличаться от эффекта интерферона, получаемого из природных источников. [c.120]

Изучение регуляции экспрессии генов гт имеет свою специфику, выражающуюся в том, что, как уже отмечалось, исследуемая проблема в основном решается применением методов генной инженерии — клонирования соответствующих генов. Учитывая тот факт, что таксономическая принадлежность реци-пиентных штаммов (в подавляющем большинстве случаев щтаммов Е. oli) и штаммов — источников донорной (клонируемой) ДНК зачастую отличается (см. разд. 5, часть II), экспрессия генов гш в таких случаях представляет вариант гетерологической экспрессии. Поэтому при интерпретации полученных результатов следует не упускать из виду, что формулируемые выводы относятся к регуляции экспрессии именно в новом для генов гт хозяине, а не к исходным клеткам (природном источнике клонированных генов). В связи с этим исследуемая проблема вынужденно во многом сводится к вопросам гетерологической, а учитывая специфику систем RM, и скоординированной экспрессии генов гт, что, понятно, не всегда отражает процессы происходящие в природном продуценте клонированных геиов. Эти замечания, очевидно, не относятся к переносу генов гт между штаммами одного вида. [c.104]

Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. соИ Rfi 5 с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур. Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида, относящаяся к группе колициногенных плазмид Е. соИ. ol El реплицируется независимо от хромосомы и присутствует в количестве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благодаря селективному маркеру в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. соИ. [c.118]

При использовании в качестве доноров ядер более продвинутых в развитии эмбрионов крупного рогатого скота 6-дневного возраста (47-—68 бластомеров), по сравнению с использованием малоклеточных эмбрионов того же возраста (около 30 бластомеров), достигается более высокая эффективность слияния бластомера и ооцита, дробления эмбрионов и развития до стадии бластоцисты (В.И. Захарченко и др., 1996). Эффективность развития клонированных эмбрионов крупного рогатого скота выше при использовании в качестве источника бластомеров морул на стадии прекавитации. При этом свежевымытые морулы являются лучшими донорами ядер, чем развившиеся in vitro. [c.219]

Описанный в гл. 19 метод клонирования чужеродных последовате ьностей в бактериофагах или плазмидах может быть использован и для встраивания генов в эукариотические вирусы. Путем внесения необходимых разрывов рестриктазами и последующего объединения полученных фрагментов глобиновый, инсулиновый и другие гены из множества источников были встроены в эукариотические вирусные векторы. Один из наиболее распространенных векторов-обезьяний вирус 8У-40, который может размножаться в клетках ряда млекопитающих. Новые гены могут быть встроены в область ранних или поздних генов транскрипционной единицы вируса. Их экспрессия включает стадию образования РНК-предше-ственника, на 5 -конце которого обычно имеются вирусные последовательности, за которыми следует последовательность встроенного гена. Такие РНК подвергаются нормальному сплайсингу, как показано на рис. 26.8. [c.325]

Ретровирусы оказались очень полезным инструментом современных генно-инженерных исследований. Они служат источником для получения практически чистой обратной транскриптазы - фермента, играющего важнейшую роль в многочисленных работах, основанных на клонировании эукариотических генов (см. гл. 9). Так, очищенную индивидуальную мРНК, кодирующую интересующий нас белок, как правило, выделить гораздо легче, чем фрагмент ДНК генома, кодирующий тот же белок. Затем с помощью обратной транскриптазы можно получить ДНК-копию этой мРНК и встроить ее в подходящую плазмиду для клонирования и наработки значительных количеств нужной ДНК. В дальнейшем мы еще вернемся к обсуждению этих методических подходов. [c.51]

При получении ДНК этим методом выход составляет 75—80% для плазмидной ДНК с мол. массой 7,4- 10 —60-10 и для фрагментов, полученных под действием рестриктазы Есо RI с размерами от 0,75-10 до 13,9-10 . ДНК, экстрагируемая с помош,ью агаразы, вызывает трансформацию фактически с той же частотой (для клеток Е. oli), что и ДНК, не контактировавшая с этим ферментом. Извлеченные из гелей фрагменты ДНК с успехом использовались в экспериментах по клонированию в качестве источника или носителя генетической информации [11]. [c.145]

Клетки нз всех лунок, оказавшиеся при скрининге положительными, надо субкультивпровать. Для этого переносите содержимое этих лунок в 24-луночиый планшет и добавьте в каждую лунку по 0,5 мл свежей среды. Клетки из такого планшета могут служить источником для клонирования клеток данной гибридомной линии кроме того, их можно рассеять на чашке Петри диаметром 90 мм и заморозить. Если слияние оказалось очень удачным, можно сразу не справиться с размножением и клонированием слишком большого количества клеток. В такой ситуации лучше выбрать только пять или десять положительных колоний для немедленного их размножения, а остальные заморозить до проведения дальнейших исследований. После размножения колоний в планшете с 24 лунками скрининг следует повторить и, кроме того, провести и более жесткий скрининг другим способом. Если в результате слияния во многих лунках наблюдается рост клеток и обнаруживаются антитела к -галактозидазе, но не обнаруживается антител к белковому продукту встроенного фрагмента, тогда единственно, что остается делать, — это повторить слияние в тех же условиях, в которых проводилось предыдущее. Если, однако, в результате слияния вообще образуется небольшое число клонов гибридных клеток, тогда стоит попробовать внести изменения в методику слияния. К ним относятся использование так называемого питающего слоя для роста клеток и внесение в среду добавок. [c.192]

Описанные ранее системы клеток эукариотов обеспечивают только-кратковременную экспрессию генов-спутников (passenger genes) либо потому, что клетки-хозяева погибают вследствие литической инфекции, либо потому, что химерные геномы только кратковременно присутствуют в клетках. Линии клеток, которые непрерывно экспрессируют индивидуальные клонированные гены вируса гриппа, могут обеспечивать более удобный источник белка. Более того, используя активность слияния НА, они могут привести к развитию систем для доставки экзогенных генов и белков к клеткам. И наконец, они открывают путь исследованиям в области регуляции цитотоксических Т-клеточных ответов на вирусспецифические поверхностные антигены. [c.177]

Выбор сыворотки. Отбору сыворотки необходимо уделять особое внимание. Сыворотки из различных источников сильно варьируют по свойствам. Надо проверять также каждую партию сывороток. Наибольшей способностью поддерживать рост гибридных клеток обладает сыворотка плода коровы (СПК). Чаще всего используют неинактивнрованную сыворотку, хотя некоторые исследователи предпочитают инактивировать ее прогреванием при 56°С в течение 30 мин для уменьшения возможной токсичности компонентов комплемента. СПК является одним из самых дорогих компонентов среды культивирования, поэтому с ней необходимо обращаться весьма экономно. Для культивирования клеток сразу после слияния, а также для клонирования используют высокую концентрацию СПК (15—20%). Как только гибридомы отобраны, их можно постепенно переводить иа рост в 10% СПК. Если клетки хорошо адаптировались, то концентрацию СПК можно снизить до 5%. [c.98]

Благодаря клонированию гомеозисных генов и гибридизации ДНК-ДНК из разных источников показано, что все исследованные гомеозисные гены дрозофилы содержат участок одинаковой нуклеотидной последовательности, названной гомеодоменом. Гомологичные последовательности найдены в ДНК амфибий, мышей, че- [c.426]

Прн иммунохимическом анализе внеклеточных участков рецепторов, снятых с клеточной поверхности с помощью трипсина, был установлен, на первый взгляд, удивительный факт. Оказалось, что в составе протеолитических фрагментов клеточных белков содержатся такие продукты, которые взаимодействуют не только с иммобилизованными лигандами, но и с иммобилизованными антителами к тем же лигандам. В описываемых экспериментах клетки культивировали в среде, содержащей меченую аминокислоту. Источником клеток служили либо покоящиеся макрофаги из брюшной полости, либо костно-мозговые фнбро-бласты кролика, подвергнутые клонированию in vitro. Ряд ключевых экспериментов выполняли на клетках макрофагоподобиои линии Р388 Di (мышь). [c.79]

Если клетки после слияния рассевают в лунки панели для микротитрования, то гибридомы, продуцирующие антитела нужной специфичности, затем пересаживают в 24 луночные панели для культуры тканей с объемом лунок 2 мл. Далее при образовании монослоя и окращивания среды в желтый цвет, супернатант можно повторно тестировать, используя определенный набор антигенов. Если результаты тестирования удовлетворительные, то гибридому наращивают в нескольких лунках, затем в универсальных контейнерах и далее во флаконах постепенно возрастающего объема. К этому времени обычно уже происходит самопроизвольное клонирование клеток. Тот клон, который отличается наилучщим ростом (предполагаемый источник антител), постепенно получает преимущество над всеми другими в культуре. [c.138]

Существуют различные источники ВЭБ, но наиболее широко используют линию клеток мармозетки В95-8. Эта линия имеет- ся во многих институтах, однако в случае затруднений автор настоящей главы готов ее предоставить. Весьма желательно, чтобы линия, используемая для репликации вируса, была свободна от микоплазм. В присутствии микоплазм эффективность клонирования В-лимфоцитов, инфицированных ВЭБ, резко падает, так же как и способность к стабильному росту. Проверять линию на контаминацию микоплазмами следует не только прп поступлении ее в лабораторию, но и регулярно во время всех пересевов. [c.155]

В исследованиях применяли ксеногенную иммунизацию, т.е. крыс иммунизировали клетками лимфом мышей, поскольку при внутривидовой иммунизации трудно ожидать образования антител, распознающих клетки этого же вида животных как чужеродные. Для описанных здесь методических подходов антигенным материалом служили пре-В-клеточные лимфомы, однако это не означает, что данные подходы применимы к анализу только таких клеток. И нам, и еще ряду исследователей удавалось успешно использовать другие В-клеточные трансформированные линии для индукции образования антител к детерминантам их плазматических мембран. Клонированные популяции клеток лимфом являются идеальным источником антигенного материала в силу целого ряда причин. 1) Если при ксеногенной иммунизации в качестве антигена используют живые клетки лимфом, то обычно получают сильные ответы, которые легко воспроизводятся. 2) Иммунизация клонированной клеточной популяцией, такой как пре-В- или плазматические клетки, дает возможность направить ответ против гомогенного клеточного источника антигена в нормальных тканях клетки такого типа могут присутствовать в очень малых количествах. 3) Иммунизируя животных и анализируя эффекты иммунизации в соответствии с описанными здесь методиками, можно практически гарантировать получение антител против детерминант клеточ- [c.176]

Приняв решение о клонировании какого-либо эукариотического гена, прежде всего необходимо ответить на вопрос нужна ли экспрессия рекомбинантного гена в клетках микроорганизмов или же можно ограничиться исследованием его структуры Очевидно, что в первом случае нужно думать о создании клонотеки безинтронных кДНК, а во втором - клонотеки геномной ДНК исследуемого объекта, что в ряде случаев технически менее сложно. Задача становится более трудной, если отсутствуют сведения о первичной структуре клонируемого гена. Тогда единственным источником получения частичной информации о последовательности его нуклеотидов может быть кодируемый этим геном белок. [c.251]

Разработка методов введения генов в зародышевые клетки млекопитаюших является крупнейшим достижением современной биологии. Получаемые при этом трансгенные животные дают возможность изучать регуляцию генов в процессе эмбриогенеза и дифференцировки, исследовать действие онкогенов, наблюдать взаимодействие клеток при формировании иммунной системы и т.д. Само животное представляет собой одновременно экспериментальную систему для выявления эффекта клонированных генов, модель для исследования генетических болезней человека и источник полезных (но чуждых для него) белков. [c.410]

Для анализа различий нуклеотидных последовательностей аллелей чрезвычайно полезны карты сайтов эндонуклеаз рестрикции. Например, используя в качестве зонда для гибридизации клонированный фрагмент из кластера Р-глобиновых генов человека, при помощи эндонуклеазного расщепления и ДНК-блоттинга можно исследовать структуру Р-глобиновой области из разных источников (рис. III.6). Если размер фрагмента генома, который гибридизуется с зондом, различен, это означает, что различна и последовательность нуклеотидов в данном сайте рестрикции или между двумя сайтами вследствие делеции либо инсерции отсутствие гиб-ридизующегося фрагмента означает, что делегирована целая область. Такие изменения, или поли- [c.11]

Смотреть страницы где упоминается термин Источники ДНК для клонирования: [c.27] [c.116] [c.293] [c.126] [c.88] [c.111] [c.136] [c.166] [c.189] [c.154] [c.156] [c.174] [c.174] [c.275] [c.76] [c.303] [c.307] [c.96] [c.183] [c.59]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология