Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот

II 1.1.7. Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот в геле [c.386]

Методы препаративного электрофореза можно также использовать и для разделения нуклеиновых кислот. В принципе для электрофореза нуклеиновых кислот пригодно большинство типов приборов, которые применяются для препаративного электрофореза в геле (см. разд. 1.11.4). [c.387]

В 70-е годы был описан целый ряд других устройств для препаративного фракционирования нуклеиновых кислот электрофорезом при вертикальном расположении геля, однако по производительности, простоте и надежности они явно уступают рассмотренным выше примерам. [c.167]

Поскольку разные ионы обладают разной подвижностью, на основе электрофореза возможно разделение веществ, молекулы которых могут быть заряжены. К их числу относятся важнейшие биополимеры— белки и нуклеиновые кислоты. Белки содержат, как правило, много NH2- и других групп, способных присоединять протоны и тем самым заряжаться положительно. Они содержат также много карбоксильных групп (СООН), которые, ионизуясь, дают отрицательно заряженные ионы СОО . Степень протонирования и степень ионизации отдельных групп, а следовательно, и заряд белковой молекулы зависят от pH среды. В кислой среде белки заряжены положительно, в щелочной — отрицательно. Нуклеиновые кислоты содержат остатки фосфорной кислоты, которые уже в слабо кислой, а тем более в нейтральной и щелочной средах ионизированы, т. е. несут отрицательный заряд, в связи с чем нуклеиновые кислоты находятся в растворе в виде полианионов. Поэтому электрофорез является важнейшим методом препаративного разделения и анализа смесей белков и смесей нуклеиновых кислот. [c.330]

Для аналитического и препаративного выделения и исследования свойств высокомолекулярных биополимеров — белков, протеидов, полипептидов и нуклеиновых кислот, а также для отделения взвешенных в жидкости частиц, не отделяемых фильтрацией, используют эффект электрофореза — движения под действием внешнего электрического поля дисперсных частиц, находящихся во взвешенном состоянии в жидкой или газообразной среде. Электрофоретические приборы описаны в табл. 24. [c.278]

В отличие от гетерогенных процессов фракционирование смеси вещества в однофазной системе основывается не на перераспределении веществ при установлении равновесия, а на кинетике перемещения компонентов в силовом поле (электрическом, гравитационном) или при наличии градиента концентрации. На этих принципах основаны методы электрофореза, седиментации и диффузии. Если рассматривать сочетание аналитического и препаративного фракционирования, то наибольшее внимание следует уделить электрофорезу. Сложные смеси веществ могут быть с успехом разделены на основе использования этого метода. Во многих случаях он является равноценным по сравнению с лучшими вариантами хроматографии, а для некоторых систем даже превосходит хроматографические методы по эффективности. Особенно важным оказалось использование электрофореза при фракционировании смесей белков и нуклеиновых кислот в колонке, заполненной гелями как природных, так и синтетических полимеров. Степень разделения зон веществ при фракционировании методом электрофореза определяется отношением подвижностей компонентов в электрическом поле. Увеличение высоты колонки здесь также приводит к лучшему разделению компонентов, как и при хроматографии, хотя при электрофорезе нет многократного повторения элементарных актов межфазного переноса. [c.9]

Трудно переоценить значение методов разделения. Без них немыслима работа в обширных отраслях химии. Например, если бы не существовало бумажной и ионообменной хроматографии и электрофореза, то химия белков и нуклеиновых кислот, химия протеинов и соответствующая область молекулярной биологии едва ли достигли бы современного уровня развития. Методы противоточного распределения очень облегчили изучение антибиотиков, полипептидов и других соединений, а также позволили разделить многочисленные синтетические смеси. Без адсорбционной хроматографии нельзя себе представить современную химию природных соединений (витаминов, терпенов, стероидных гормонов и т. д.). Газовая хроматография — один из методов контроля, наиболее широко применяемый в промышленном крупнотоннажном органическом синтезе. Современные методы разделения используются не только в препаративных, но и в аналитических целях, а также в промышленности. Все эти методы интенсивно развиваются. В настоящее время точность и скорость разделения методами газовой и жидкостной [c.12]

Биологические макромолекулы — белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды — находятся в растворе в виде частиц, которые по своим размерам соответствуют коллоидным частицам. Они несут определенный электрический заряд благодаря наличию групп, способных к электролитической диссоциации. Общий заряд данной частицы определяется прежде всего концентрацией Н+- ионов в среде и может изменяться при ее взаимодействии с ионами малой молекулярной массы или другими макромолекулами. Под действием электрического поля заряженные частицы перемещаются к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда. Такое явление носит название электрофореза. Скорость движения частицы (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью. Она имеет размерность ом .с- -В , а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда. Различия в подвижности частиц служат основой для разделения смесей веществ в аналитических или препаративных целях. Определение подвижности используется также для характеристики вещества, [c.11]

Высокая разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле на вела исследователей на мысль об использовании его для очистки белков и нуклеиновых кислот в препаративных целях. Для этого были разработаны разл Ичные типы приборов и буферных систем, позволившие увеличить производительность метода без ухудшения. качества разделения. [c.113]

Приготовление пробы. Обычно препаративный электрофорез в полиакриламидном геле не используют в качестве одного из начальных этапов в очистке белков и нуклеиновых кислот. Для предварительного грубого фракционирования компонентов омесей применяют методы хроматографии, высаливания или осаждения. Чтобы провести электрофоретическое разделение, пробу необходимо сконцентрировать до 5 мл для однородной системы и до 10—20 мл для неоднородной. От избытка солей можно избавиться при помощи диализа или гель-фильтрации. Концентрация солей в исследуемом растворе должна быть такой же, как в буфере концентрирующего геля. Если же этот гель не попользуется, то пробу диализуют против буфера разделяющего геля, разведенного в 5 раз. Медленное вхождение пробы в гель во время электрофореза свидетельствует о слишком высокой концентрации солей. Любой осадок, присутствующий в пробе, следует удалять центрифугированием или фильтрованием через миллипоровый фильтр, так как он может закупорить разделяющий гель. [c.117]

Использование метода электрофореза в полиакриламидном геле для анализа и разделения сложных смесей белков и нуклеиновых кислот значительно расширило наши знания о многих клеточных и вирусных системах. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет ряд преимуществ перед другими аналитическими методами он отличается простотой в исполнении, хорошей воспроизводимостью результатов и не требует сложного оборудования. В комбинации с двумерным разделением и изоэлектрофокусированием он может быть использован не только для аналитических, но и для препаративных целей. [c.118]

Рассмотрим основные технические приемы приготовления и использования гелей для электрофореза. Это рассмотрение целесообразно провести отдельно для трех вариантов аналитического электрофореза вертикального в трубках, вертикального в пластинах и горизонтального в пластинах. Приемы препаративного электрофореза будут рассмотрены отдельно. Методы подготовки препаратов, выбора буферов и различных добавок к ним, а также условий протекания самого процесса электрофореза будут детально исследованы далее, в главах 3 и 4, посвященных описанию различных вариантов электрофоретического фракционирования белков и нуклеиновых кислот. [c.21]

С помощью гель-электрофореза молекулы, имеющие в иных условиях близкие электрофоретические подвижности, разделяются по их размерам. Первоначально для этой цели использовали крахмальный гель [128], который и до сих пор применяется в аналитических целях. Однако крахмальный гель никогда не удавалось успешно использовать в препаративных масштабах. Универсальным средством для анализа белков (а теперь и нуклеиновых кислот) в биохимических лабораториях стал полиакриламидный гель [129]. Он также пригоден и для препаративного электрофореза. Поскольку этот гель, представляющий собой трехмерную сетку нитей, образующих поры разных размеров [130], обладает разной эффективной вязкостью в зависимости от размеров молекул, уравнение (5.2) для электро- [c.215]

По-видимому, для препаративного электрофореза нуклеиновых кислот следует предпочесть другую систему [Polsky et al., 1978]. В этом случае разделение 35 мг рестриктазных фрагментов ДНК проводили в горизонтальной пластине агарозы сечением 45 см1 Для внесения препарата в гель и его элюции служили прямоугольные камеры, прилегающие к торцам пластины (рис. 43), Камера элюции объемом 12 мл была отделена от сле- [c.166]

Тонкослойная хроматография (ТСХ английское TL ) и предшествовавший ей метод хродгатографии на бумаге до середины 70-х годов занимали центральное место в исследованиях структуры белков и нуклеиновых кислот. В последнее десятилетие эти методы были явно оттеснены электрофорезом и высокоэффективной жидкостной колоночной хроматографией при высоком давлении. Оба метода превосходят ТСХ но разрешающей способности, а второй из них — и по скорости анализа. Кроме того, в результате ЖХВД экспериментатор получает уже разделенные жидкие фракции исходного препарата, в то время как после ТСХ ему надо еш,е локализовать пятна на пластинке, а в случае необходимости дальнейшего анализа — выполнить длительные операции элюции из них веш,ества. Точное и проводимое в ходе самого фракционирования определение микроколичеств вещества во фракциях прп ЖХВД, которое позволяют осуществить высокочувствительные детекторы и интегрирующие устройства современных жидкостных хроматографов, оставляет далеко позади соответствующие возможности ТСХ — ввиду плохой воспроизводимости процессов элюции из пятен и высокого уровня фона или самопоглощения в слое носителя при использовании оптических, флюоресцентных и радиоактивных методов оценки количества вещества в пятнах на пластинке без его элюции. Наконец, в препаративном варианте фракционирования количественные возможности ТСХ на несколько порядков меньше, чем у обычной колоночной хроматографии и даже у электрофореза. [c.457]

Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его> слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакриламида в самых широких пределах. Электроос-мотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [c.299]

В горизонтальном приборе для электрофореза можно вести электрофоретическую элюцию одновременно из нескольких полосок, вырезанных из препаративного геля [Wienand et al., 1979]. На рабочий столик прибора устанавливают пластину 10/о-ного геля агарозы, примерно на 2 мм более толстую, чем исходный гель, в котором проводили фракционирование нуклеиновых кислот. В этой пластине параллельно электродным резервуарам вырезают ряд прямоугольных окон. Ширина окон должна быть примерно вдвое больше, чем ширина полосок элюируемого геля. Диализные мешочки завязывают с двух концов и прорезают вдоль. В окна заливают немного рабочего буфера и укладывают диализные мешочки так, что пленка каждого из них выстилает дно и боковые стороны одного из окон, а разрез в пленке раС полагается сверху. Через эти разрезы в мешочки, заполненные тем же буфером, вносят полоски геля и укладывают их на дно [c.159]

Для препаративного электрофореза ДНК и РНК в гелях агарозы Хаген использовал трубки диаметром 5,9 или 7,7 см, просто обрезав для этой цели мерные цилиндры на 1 или 2 л. Расплавленную в соответствующем буфере агарозу он заливал на высоту 12—15 см. Камера элюции на нижнем конце цилиндра была образована двумя сетками и диализной мембраной. Элюцию вели непрерывно со скоростью 0,8 мл/мин. В качестве элюента использовали нижний электродный буфер, в который для охлаждения цилиндр погружали на всю высоту геля. Буфер поступал в камеру элюции по ее периферии и отсасывался через трубку, выведенную из центра нижней сетки камеры [Hagen, 1979]. Агароза не прилипает к стеклу цилиндра, поэтому во избежание миграции нуклеиновых кислот по зазору вдоль стенок препарат вносили в углубление меньшего диаметра, чем цилиндр, сформированное на верхнем торце геля агарозы при ее застывании. Заметного перетекания буфера по зазору не происходило, так как гель находился под гидростатическим давлением столба жидкости высотой 10 см (верхний электродный буфер). Проблему нагревания геля решали путем снижения плотности тока в 3— [c.166]

Третий физический метод — электрофорез, не получил такого широкого распространения в исследовании вирусов, как ультрацентрифугирование. Классический метод Тизелиуса (фронтальный электрофорез) для очистки и фракционирования вирусов непри-годен. Более удобен зональный электрофорез в градиенте плотности, предложенный в 1953 г. Брекком [217]. Для препаративной очистки вирусов животных этот метод стали применять с 1958 г. после работ Крамера с сотр. [271]. Очень широкое распространение для фракционирования белков и нуклеиновых кислот получил метод дискового электрофореза в полиакриламидном геле, предложенный в 1962 г, Рейсфельдом с сотр, [684]. [c.44]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология