Использование меченых зондов

Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК позволили исследователям разобраться в природе многих наследственных болезней человека. Эти методы дают возможность идентифицировать специфические мутации, приводящие к заболеванию [1—6], а также полиморфные участки ДНК, используемые в качестве маркеров в генетическом анализе [7—11]. Благодаря развитию методов выявления нуклеотидных замен стала реальностью пренатальная диагностика многих наследственных болезней человека. Если ген, отвечающий за заболевание, известен, соответствующую мутацию можно обнаружить в геномной ДНК или в РНК при помощи блот-гибридизации с использованием меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. В том случае, когда мутировавшая нуклеотидная последовательность неизвестна, замены нуклеотидов можно определить по полиморфизму длины рестрикционных фрагментов <ПДРФ) [7]. ПДРФ обнаруживается по наличию или отсутствию сайта рестрикции во фрагменте геномной ДНК при гибридизации меченого ДНК-зонда с обработанной рестриктазами геномной ДНК, расфракционированной по размеру в агарозном геле и перенесенной на мембранный фильтр. Этот метод оказался очень эффективным для выявления как значимых мутаций, так и нейтрального полиморфизма в геноме человека и других организмов. Однако большую часть мутаций и полиморфных участков генома не удается обнаружить с помощью анализа ПДРФ, поскольку вероятность того, что замена нуклеотида изменит именно сайт рестрикции, низка. Так, например, многие точковые мутации гена р-глобина человека, вызывающие талассемию, не изменяют сайтов рестрикции, а потому не могут быть непосред- [c.123]

Первая глава данного тома касается использования плаз-мидных векторов, имеющих в своем составе высокоспецифичные промоторы РНК-полимераз некоторых бактериофагов. Такие векторные молекулы позволяют получать радиоактивно меченные зонды, которые благодаря своим уникальным свойствам все шире применяются сейчас в исследованиях структуры и функций нуклеиновых кислот. Подобные системы на основе космидных векторов рассматриваются во второй главе. Эти векторы разработаны для того, чтобы сделать менее трудоемкими прогулки по хромосомам высших организмов. Фаговые промоторы здесь расположены таким образом, что синтезируемый радиоактивно меченный зонд соответствует концевой области клонированной ДНК, а это облегчает поиск клонов, содержащих перекрывающиеся сегменты ДНК. [c.8]

Рекомбинантные ДНК могут быть широко использованы для выявления возбудителей методом молекулярной гибридизации. Этот метод позволяет быстро и точно диагностировать инфекционные болезни, может использоваться для пренатального диагноза генетических дефектов, выявления животных — носителей возбудителя. Метод основан на использовании зондов — ДНК, меченных радиоактивными соединениями или биочипами, с последующей гибридизацией зондов с образцами ткани животного — носителя возбудителя болезни. Это особенно ценно для выявления скрытых инфекций (хламидиозы, медленные инфекции). Использование молекулярных зондов на основе ДНК позволяет идентифицировать близких по своим свойствам возбудителей. [c.254]

Использование меченых зондов [c.163]

Позже разработан новый метод исследования динамики макромолекул в растворах — ЯМР спин-меченых макромолекул [9]. Он основан на исследовании парамагнитного уширения линий ЯМР макромолекул, индуцированного спиновыми метками. На примере спин-меченого поливинилпиридина показано, что для гибкоцепных полимеров доступность звеньев макромолекулы относительно спиновых меток чужих макромолекул такая же, как и по отношению к низкомолекулярному радикалу-зонду и к собственным спиновым меткам. Другими словами, клубки макромолекул свободно проникают друг в друга. При совместном использовании оба метода — ЭПР и ЯМР — дают исчерпывающую информацию [c.317]

Различные активности молчащих и активных кассет могут зависеть от структуры хроматина. Использование зондов, представляющих области, прилегающие к каждой из кассет, позволяет определить структуру хроматина с помощью метода концевого мечения. Все кассеты содержат сайты, сверхчувствительные к ДНКазе I, однако существуют значительные различия по этому признаку между молчащими и активными кассетами. Локализация чувствительных сайтов показана на рис. 37.19. [c.487]

При гель-электрофорезе транскриптов, образовавшихся в условиях преждевременной терминации, как правило, не обнаруживается дискретных больших фрагментов. Л ежду тем некоторые последовательности, по-видимому, содержат внутренние слабые сайты терминации в результате в геле обнаруживаются полосы, соответствующие достаточно большим, но неполноразмерным траискриптам. Количество таких полос уменьшается по мере возрастания количества полноразмерных транскриптов при использовании более высоких концентраций нуклеотидов, но даже при самых высоких концентрациях они никогда не исчезают полностью. Именно эти дискретные продукты, получающиеся в результате преждевременной терминации, служат основным источником трудностей прн анализе результатов опытов по защите от действия РНКазы. Следовательно, требуется проводить анализ меченого зонда с помощью гель-электро-фореза до его использования, особенно в случае экспериментов по защите от РНКазы. [c.24]

В настоящее время все более широкое применение находит использование РНК в качестве специфических гибридизационных зондов, а также в качестве субстратов и реагентов при анализе широкого круга биологических процессов. Чрезвычайно высокая специфичность кодируемых фагами полимераз и небольшие размеры их промоторов (во многих случаях это всего 15 пар оснований) открывают путь новым методическим подходам, которые не следует игнорировать. Возможность использования готовых коммерческих наборов или отдельных компонентов для синтеза РНК in vitro с помощью РНК-полимераз фагов SP6, Т7 и ТЗ значительно облегчает решение экспериментальных задач, в которых требуется синтезировать меченые зонды, а некоторые уникальные функции и специфические свойства РНК в ряде случаев делают описанные системы просто незаменимыми. [c.38]

Выделяют ДНК из различных штаммов Salmonella. Выделяют ее прямо из колоний, используя методику быстрого выделения ДНК- Затем выделенную ДНК расщепляют разными рестрикционными эндонуклеазами, проводят электрофорез в агарозном геле и разделенные фрагменты переносят на нитроцеллюлозу. После этого проводят гибридизацию таких полосок нитроцеллюлозы с ДНК, меченной с помощью ник-трансляции. С этими полосками экспонируют рентгеновскую пленку. После того как пленка проявлена, мол<но определить размеры тех рестрикционных фрагментов, которые гомологичны использованной ДНК-зонду. [c.50]

Типы полиморфизма ДНК. Наиболее распространенный тип полиморфизма ДНК-рестрикционный полиморфизм. Если в сайте узнавания для какой-то рестриктазы происходит точечная мутация, фермент не распознает свой сайт и не разрезает ДНК (рис. 2.84). Имея под рукой специфические ДНК-зонды и рестриктазы, можно анализировать ДНК. Рестрикционные фрагменты ДНК (рестрикты) различаются по длине (полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов). Они идентифицируются по различной подвижности после гибридизации по Саузерну (рис. 6.5). В настоящее время метод гибридизации по Саузерну включает радиоактивное мечение. Вероятно, в будущем появится возможность нерадиоактивного мечения фрагментов ДНК. Точечные мутации, заменяющие один нуклеотид на другой в некодирующем районе ДНК, встречаются очень часто. Немногие систематические исследования изменчивости ДНК проводились путем анализа с использованием большого количества рестриктаз в небольшой выборке особей (10 12). Результаты, полученные для хорошо изученных к настоящему времени областей генома (гемоглобина, альбумина и сегментов ДНК с неизвестной функцией из разных хромосом) [1143 1742 1959], свидетельствуют о том, что уровень нуклеотидной изменчивости приблизительно на порядок выше, чем наблюдаемый по структурным генам, кодирующим белки. Это означает, что разница между случайно выбранными хромосомами составляет в среднем 75оо" 7г5о нуклеотидов (гетерозиготность = = 0,001 — 0,004). Особенно подходят для выявления вариантов ДНК ферменты Мер и Тая1, узнающие метилированный динуклеотид СрО. Большинство вариантов по длине рестрикционных фрагментов диморфны, т. е. имеют только два аллеля -присутствие ( + ) или отсутствие ( —) сайта рестрикции. Частота полиморфного ва- [c.288]

Приведенные выше условия гибридизации разработаны для проведения гибридизации с уникальной последовательностью бактериальной ДНК, когда на фйльтр из геля элюировано в сумме около 1 мкг бактериальной ДНК- Если вносится больше меченого зонда, то можно получить более сильный сигнал и уменьшить время гибридизации. При использовании зонда, меченного для получения низкого фона, гибридизацию надо вести в течение не более трех часов. Неизвестно, почему при использовании меченной тРНК при длительной гибридизации получается высокий фон. [c.128]

РНКазное расщепление и ДГГЭ можно использовать для непосредственного исследования фрагментов геномной ДНК, минуя стадию клонирования. Работая с равномерно меченными зондами, обладающими высокой удельной активностью (примерно 200—400 Ки/ммоль по одному из нуклеотидов), можно любым из этих методов получить желаемый результат, имея изначально 5—10 мкг геномной ДНК человека и проводя радиоавтографию 24 ч. Чем проще организм, тем выше чувствительность методов. Хотя получаемые результаты в большинстве своем можно оценить высоко, непосредственное использование суммарной геномной ДНК ставит перед исследователем ряд проблем. Это, во-первых, нередко низкое отношение сигнала к фону, особенно при РНКазном расщеплении. Во-вторых, активность равномерно меченных фосфором зондов должна быть настолько высокой, чтобы использовать их в течение дня или двух (и избежать таким образом высокого фона за счет радиоактивного распада). В-третьих, при проведении некоторых анализов, особенно в случае множественных тестов, лимитирующим фактором может стать количество геномной ДНК. Любой тест тем предпочтительнее, чем меньшее количество ДНК требует. [c.138]

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

Можно посчитать, что при обычной гибридизации in situ с использованием меченного тритием зонда с удельной радиоактивностью 10 распад./мин на 1 мкг уникальный ген размерами около 10 пар оснований обеспечит образование одного зерна серебра на автографе после 100 дней экспозиции. Это. безусловно, слишком долгий срок, неприемлемый еще и из-за неблагоприятного отношения сигнал/шум в этих условиях. [c.306]

Этот вариант ПЦР разработан для амплификации последовательностей ДНК или РНК непосредственно на фиксированных препаратах тканей, клеток или хромосом [284, 285]. Если с помощью обычной гибридизации in situ с использованием меченой ДНК в качестве зонда можно обнаруживать до 10 копий анализируемых последовательностей на клетку, то чувствительность ПЦР in situ в 10 раз выше, т.е. позволяет обнаруживать одну ко- [c.213]

Использование, спин-меченых молекул фосфолипида типа СИ1(/ге, п) и AXVI в качестве зондов при исследовании фосфолипидных слоев позволяет измерять времена, характеризующие поступательную диффузию молекул фосфолипида в слое. [c.175]

Этот прием нащел применение в синтезе спин-меченых соединений [10]. Однако гидролитическая неустойчивость оксазолидино-вого цикла ограничивает использование таких спин-меток и зондов. [c.183]

При гель-электрофорезе меченых транскриптов было обнаружено, что сами матрицы различаются по способности давать полноразмерные транскрипты. Даже в условиях такой низкой концентрации нуклеозидтрифосфатов, как 4 мкМ, при использовании в качестве матрицы ДНК гена hprt-ыышк синтезируется значительное количество полноразмерной РНК-зонда, тогда как на ДНК гомео-бокса при концентрации нуклеозидтрифосфатов 15 мкМ полноразмерных транскриптов почти не синтезируется (И. Дж. Джексон, неопубликованные данные). [c.24]

РНК- (или ДНК-) зонд участвует в реакции так, как если бы он просто входил в состав фракции последовательностей, с которой он транскрибировался. Эту фракцию выявляют, сравнивая кривую гибридизации радиоактивного зонда с кривой реассоциации всей ДНК. Поэтому значения при которых гибридизуется меченая РНК, могут быть использованы для определения частот повторяемости соответствующих последовательностей генома. Когда зондом служит индивидуальная мРНК, она гибридизуется при единственном значении СоЬ/г, зависящем от частоты повторяемости гена или генов, представляющих ее в геноме. Для уникального гена эта величина будет такой же, как для неповторяющейся ДНК, в то время как для повторяющихся генов будет наблюдаться соответствующее уменьшение значения При использовании популяции молекул мРНК каждая мРНК гибридизуется при определенном значении Со х/г так, что кривая в целом представляет собой сумму кривых гибридизации индивидуальных компонентов. Такую кривую можно разложить на составляющие ее компоненты так же, как и кривую реассоциации самой ДНК генома. [c.231]

Если фермент вносит разрыв в интрон, образуются два фрагмента, которые могут гибридизоваться с меченой кДНК-зондом. Но при использовании зондов, специфичных по отношению к 5 - и З -концам, каждый фрагмент гибридизуется только с одним зондом. [c.252]

Подобные структурные изменения хроматина могут происходить у дрожжей в области центромеры. В данном случае кажется вероятным, что вместо видимого кинетохора сама нить хроматина вьшолняет функцию центромеры. Строение центромерной области было исследовано методом непрямого концевого мечения с использованием коротких фрагментов ДНК в качестве зОпдов. С помощью зондов были идентифицированы два сверхчувствительных к ДНКазе I сайта, локализованные с обеих сторон от областей I и III. Это короткие консервативные последовательности центромерной ДНК, приведенные на рис. 28.11. Область размером 220-250 п.н. между двумя сверхчувствительными сайтами защищена от нуклеазного расщепления. [c.392]

Рис. 18.17. Картирование клонированных генов человека при использовании гибридов соматических клеток мыши и человека с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, служащие маркерами данных хромосом, выявляются с помощью гель-электрофореза. Рестрикционные фрагменты ДНК, выделенной из гибридной линии, разделяют электрофорезом в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре проводят их гибридизацию с зондом, меченным радиоактивными изотопами. (По Shows ТВ. et al, 1982. Adv. Hum. Genet., 12, 341-452.)

Липкие концы ДНК. Комплементарные одноцепочечные участки ДНК, выступающие на противоположных концах двухцепочечной молекулы. Ник-трансляция. Метод введения метки в ДНК основан на том, что ДНК-полимераза Es heri hia oli способна осуществлять деградацию одной из цепей ДНК, в которой до этого был сделан разрез ( ник ), и тут же строить новую цепь, используя неповрежденную в качестве матрицы. Если в реакционную смесь ввести меченые нуклеозидтрифосфаты, то вновь образуемая цепь окажется радиоактивной, что дает возможность ее использования в качестве зонда. [c.51]

ЭПР-спектроскопия позволяет измерять плотность упаковки бислоя. Спин-меченые жирные кислоты, содержащие нитроксиль-ную группировку на разном расстоянии от полярной СООН-группы, встраиваясь в бислой, ориентируются в поперечном направлении. Вид ЭПР-спектра этих зондов зависит от глубины погруже-. ния внутрь бислоя радикала с неспаренным электроном (рис. 27). Использование набора таких зондов позволяет оценить скорость вращательной подвижности и, соответственно, подвижность жирнокислотных цепей на разной глубине бислоя. [c.70]

Смотреть страницы где упоминается термин Использование меченых зондов: [c.111] [c.228] [c.116] [c.228] [c.105] [c.242] [c.169] [c.137] [c.199] [c.137] [c.199] [c.30] [c.227] [c.68] [c.299] [c.242] [c.169] [c.28] [c.181] [c.185] [c.22] [c.175] [c.74]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология