Концевого мечения метод

Рис. 30.16. С помощью метода непрямого концевого мечения определяют расстояние от сайта сверхчувствительности к ДНКазе до сайта рестрикционного расщепления.

Рис. 29.12. С помощью метода концевого мечения определяют расстояние от одноцепочечных разрывов до меченых концов.

Рассмотрим последовательность только для одной нуклеосомы. При расщеплении нуклеазой микрококков образуется мономерный фрагмент, состоящий из специфической последовательности. Если выделить ДНК и расщепить ее рестриктирующим ферментом, для которого имеется только один сайт рестрикции на этом фрагменте, то ДНК будет разрезана только в одной точке. При этом образуются два фрагмента, каждый с уникальным размером. Продукты двойного расщепления нуклеазой микрококков и рестриктирующим ферментом разделяют с помощью электрофореза в геле. Для идентификации фрагментов, образованных в результате двойного расщепления, используют специальный зонд, представляющий собой последовательность ДНК, непосредственно примыкающую к сайту рестрикции (с одной стороны). Этот метод называют непрямым концевым мечением (не совсем соответствующее название). [c.377]

Где локализованы эти сверхчувствительные сайты Их положение можно установить для индивидуальных локусов, используя метод непрямого концевого мечения, [c.388]

Различные активности молчащих и активных кассет могут зависеть от структуры хроматина. Использование зондов, представляющих области, прилегающие к каждой из кассет, позволяет определить структуру хроматина с помощью метода концевого мечения. Все кассеты содержат сайты, сверхчувствительные к ДНКазе I, однако существуют значительные различия по этому признаку между молчащими и активными кассетами. Локализация чувствительных сайтов показана на рис. 37.19. [c.487]

Как уже отмечалось выше, для определения нуклеотидных последовательностей ДНК методом Максама-Гилберта необходимо наличие фрагментов ДНК, несущих на одном из концов какую-либо метку. Отдельные частные случаи секвенирования ДНК методом химической деградации (геномное и мультиплексное секвенирование, рассматриваемые в других главах) могут проводиться даже с немечеными препаратами ДНК. Концевое мечение секвенируемых фрагментов ДНК можно осуществить при помощи различных ферментов. Так, с помощью поли-нуклеотидкиназы фага Т4 и молекулы АТФ, несущей радиоактивный фосфор в у-положении, проводится мечение 5 -концов одно- или двуцепочечного фрагмента ДНК. Эффективность мечения тупых или 5 -углубленных концов двуцепочечного фрагмента ДНК значительно ниже, -чем 5 -выступающих. Для более эффективного мечения необходим предварительный этап дефосфорилирования фрагмента ДНК с помощью щелочной фосфатазы. Особая забота должна быть проявлена при последующем удалении щелочной фосфатазы, что достигается обычно фенольной депротеинизацией, так как остаточная фосфатазная активность может резко снизить эффективность этапа мечения. Мечение путем обменной реакции позволяет обойтись без этапа дефосфорилирования и требует присутствия в реакционной смеси в качестве акцептора молекул АДФ, однако эффективность мечения при этом будет значительно ниже. [c.22]

Радиохимические методы особенно ценны в определении активного водорода, поскольку они обеспечивают высокую чувствительность анализа. Эти методы позволяют анализировать микроколичества органических соединений и определять концевые функциональные группы в некоторых полимерах. В соответствующих анализах применяют либо реакцию изотопного обмена активного водорода, содержащегося в анализируемом соединении, с тритием, содержащимся в гидроксильных группах спиртов или в тритиевой воде, либо реакцию активного водорода с алюмогидридом лития, меченным тритием. [c.246]

Данный реагент, меченный изотопом применяли для оценки содержания концевых аминогрупп в найлоне, причем результаты этой оценки использовали для калибровки спектрофотометрического метода [113. [c.315]

Дальнейшее изучение метода показало, что он не является абсолютным и не позволяет анализировать любое неизвестное соединение с использованием одного и того же калибровочного графика, построенного по результатам анализа подходящего известного соединения [20]. В этом исследовании вещества с различными (1)ормами активного водорода анализировали с использованием одной и той же порции меченого реагента. При этом для бензойной кислоты и я-бутанола были получены согласующиеся результаты, а результаты для анилина значительно отличались от соответствующих результатов, полученных с использованием меченого спирта. Растворимые образцы полиэтиленадипината, содержащие в основном концевые гидроксильные группы, хотя и давали прямолинейный калибровочный график, выделяли меньше трития, чем эквивалентное количество я-бутанола. Для того чтобы в анализе анилина количество выделяющегося трития было достаточно близким к количеству трития, выделяемого данным количеством амина, требовался свежий реагент. Этот анализ проводили с применением модифицированного оборудования, описанного ниже. Такой эффект, связанный с наличием в реагенте остаточных продуктов от предыдущих реакций, не наблюдался в анализе н-бута-нола в этом анализе можно было использовать раствор реагента, /ке использовавшийся в анализах анилина и бензойной кислоты. [c.253]

В большинстве опубликованных экспериментальных работ обсуждаются вопросы о конформации адсорбированных молекул, но ни в одной из них не применены какие-либо прямые методы определения конформаций. (В принципе такие методы могли бы быть разработаны на основе использования полимеров с мечеными концевыми группами, что позволило бы определять расстояние между концами цепей.) Поэтому все рассуждения о конформации делаются либо на основании значений доли связанных сегментов, либо на основании данных о толщине адсорбционного слоя и сопоставлении этой толщины с размерами макромолекул в растворе. Имеется много работ, в которых различными физическими методами определяется толщина адсорбированного слоя полимера. Среди других методов наиболее широкое применение нашел метод эллипсометрии, по которому можно определить толщину адсорбционного слоя и концентрацию в нем полимера, поскольку адсорбционный слой содержит связанный растворитель. [c.85]

Обычно принято считать, что пределы применимости метода концевых групп определяются точностью методов химического анализа. Однако основной источник ошибок кроется не в этом, ибо современные методы анализа (метод меченых атомов, спектральные методы, фото- [c.255]

Принцип метода состоит в том, что в аминокислоту количественно вводят группу, содержащую радиоактивные атомы затем, чтобы облегчить выделение, добавляют большое определенное количество такого же немеченого производного аминокислоты. После очистки определяют содержание Ь изотопа в смеси и сравнивают его с теоретическим количеством у изотопа для этой аминокислоты. Отношение b/у дает число молей определяемой аминокислоты. Для этой цели применяют п-иодфенил-сульфохлорид (пипсилхлорид), меченный J131 или S35. Эти производные достаточно стойки в условиях гидролиза и поэтому пригодны также для определения N-концевых аминокислот. Метод считается весьма точным, что, повидимому, подтверждается немногими появившимися в литературе данными. [c.219]

Подобные структурные изменения хроматина могут происходить у дрожжей в области центромеры. В данном случае кажется вероятным, что вместо видимого кинетохора сама нить хроматина вьшолняет функцию центромеры. Строение центромерной области было исследовано методом непрямого концевого мечения с использованием коротких фрагментов ДНК в качестве зОпдов. С помощью зондов были идентифицированы два сверхчувствительных к ДНКазе I сайта, локализованные с обеих сторон от областей I и III. Это короткие консервативные последовательности центромерной ДНК, приведенные на рис. 28.11. Область размером 220-250 п.н. между двумя сверхчувствительными сайтами защищена от нуклеазного расщепления. [c.392]

НЕПРЯМОЕ КОНЦЕВОЕ МЕЧЕНЬЕ (indire t end labeling). Метод изучения ДНК, при котором производится разрез в определенном участке молекулы и выявляются все фрагменты, содержащие последовательность, располагающуюся только с одной стороны от данного разреза с помощью такого подхода определяют расстояния от данного разрыва в молекуле ДНК до следующего. [c.523]

Концевое мечение. В этом методе меченные различным образом олигог [c.68]

Секвенирование больших фрагментов ДНК методом химической деградации по Максаму-Гилберту было возможно путем построения подробной рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК, разработки на ее основе стратегии секвенирования, заключающейся в выборе тех или иных рестриктазных фрагментов исследуемого клона, полностью перекрывающих всю длину вставки (рис. 8.1). Далее следовал этап препаративного расщепления ДНК соответствуюпщми рестрикционными эндонуклеазами, препаративный гель-электрофорез, концевое мечение элюированных фрагментов и проведение реакций химической модификации и гидролиза. Следует отметить, что данный подход к секвенированию крупных вставок методом Максама-Гилберта вполне может быть применен и в настоящее время, однако разработ- [c.234]

Характерным отличием жидких тиоколов является способность превращаться в резины при комнатной температуре за счет реакций концевых меркаптанных групп. В связи с этим наиболее важной характеристикой тиоколов является содержание 5Н-групп и среднечисленная функциональность, показывающая среднее число меркаптанных групп, приходящихся на молекулу полимера. Функциональность полимера может быть рассчитана по количеству примененного 1,2,3-трихлорпропана. Последний полностью входит в состав жидкого полимера, что было доказано методом радиолиза с применением меченого по углероду 1,2,3-трихлорпропана [23]. Функциональность полимеров зависит от количества 1,2,3-трихлорпропана и от молекулярной массы полимера (см. табл. 1). Плотность разветвленности, вычисленная по среднему числу узлов разветвления, определяется только количеством примененного сшивающего агента и не зависит от молекулярной массы полимера. [c.559]

Для определения первичной структуры коротких олигонуклеотидов (до 15 — 20 звеньев) обычно используют метод блуждающего пятна , или сзнгерпринта . Меченный по одному из концов олигонуклеотид гидролизуется экзонуклеазой с противоположного конца в условиях неполного расщепления, так что образуется набор всех возможных фрагментов. При расположении полученных таким путем олигонуклеотидов в порядке возрастания длины каждые два соседних продукта будут отличаться друг от друга на одно концевое звено. Меченое же звено у всех олигонуклеотидов является общим (рис. (78). [c.318]

Химические методы определения молекулярного веса основаны на реакциях окисления альдегидных групп, содержание которых позволяет вычислить среднечисловое значение молекулярного веса. Окислителями могут служить гипоиодит натрия [8], соли меди [9], феррацианид калия [10]. Содержание концевых восстанавливающих групп с больщой точностью может быть установлено определением радиоактивности полисахарида с меченым атомом С после взаимодействия с цианидом натрия 11]./ [c.142]

Радиоизотопные методы желательно применять для определения концевых гидроксильных групп полиэфиров, полученных поликонденсацией дикарбоновой кислоты с диолами, поскольку концентрация этих групп в конечных продуктах часто очень мала. При введении избытка диола, когда есть уверенность в том, что концевые функциональные группы в основном гидроксильные, любой точный и чувствительный метод определения этих групп является в то же время и абсолютным методом определения среднечислового молекулярного веса данного полимера. Для количественного превращения в меченое производное полиэфир обрабатывали избытком п-толуолсульфохлорида, меченного изотопом 5, в пиридине [138]. Концентрацию радиоактивной части продукта определяли по формуле (3) и по полученному значению вычисляли среднечисловой молекулярный вес анализируемого полимера. [c.82]

Один нз методов идентификации Л -концевой аминокислоты пептида нли белка состоит в замещении -аминогруппы иа такую груп-. пу, которая выдерживает гидролиз, и таким образом, после кислотного нлн ферментативного гидролиза меченую аминокислоту можно обнаружить спектрофотометрнчески, спектрофлуорометри-чески илн по радиоактивности и идентифицировать с помощью хроматографии. [c.264]

Биогенетическая взаимосвязь сквалена и холестерина предполагалась еш,е до 1926 г., однако достоверно участие сквалена в образовании углеродного скелета холестерина было установлено лишь в 1953 г. после того, как было выяснено распределение радиоактивной метки в холестерине, образующемся из меченого ацетата. Распределение меток в холестерине, полученном в опытах с ацетатом и мевалонатом, показано соответственно формулами (7), (38) и (39). Положения атомов в холестерине, полученном из [5- С]- и [3, 4- С2] мевалонатов, недавно установлено методом ЯМР [36]. В результате стереоспецифической циклизации сквалена в молекуле появляется концевая транс-метильная группа, которая метится, если используется [2- С] мевалоновая кислота из этой группы возникает 4а-метильная группа ланостерина. [c.494]

Химические методы определения молекулярных весов полисахаридов, заключающиеся главным образом в определении процентного, содержания восстанавливающих концевых моносахаридов, основаны на реакциях альдегидной группы и дают среднечисловые значения молекулярного веса. Обычными реагентами для количественного определения альдегидных групп служат окислители, такие как гипоиодит натрия, , соли меди , феррицианид калия . Реакции окисления в случае полисахаридов могут протекать нестехиометрически, так что они мало пригодны для вычисления абсолютных значений молекулярных весов, но очень удобны для сравнения по молекулярному весу различных фракций полисахарида . Весьма чувствительным методом анализа концевых восстанавливающих групп является реакция полисахаридов с меченым цианидом натрия в щелочной среде с последующим определением радиоактивности полимера этот метод неприменим, однако, к полисахаридам, разрушающимся щелочами. В тех случаях, когда полисахарид при периодатном окислении не дает формальдегида, его молекулярный вес может быть вычислен по образованию формальдегида после боргидридного восстановления альдегидных групп и последующего периодатного окисле-ния остаток полиола, получающийся из восстанавливающего моносахарида под действием боргидрида, может образовывать при окислении 1 или [c.514]

Метод Эдмана заключается во взаимодействии М-концевой 1МИН0КИСЛ0ТЫ с фенилизотиоцианатом в щелочной среде. При 1ьнейшей обработке слабой кислотой без нагревания проис-гит отщепление от цепи меченой концевой ФТГ-аминокис-гы (см. 11.1.4). ФТГ-аминокислота идентифицируется мерами тонкослойной или газожидкостной хроматографии л. 15.1). [c.349]

Уменьшение количеств белков и пептидов, необходимых для анализа их структуры, является одной из центральных проблем, стоящих перед исследователями. С целью ее решения ведется поиск новых методов изучения структуры, в частности более чувствительных способов идентификации производных аминокислот (см. с. 61). Один из перспективных подходов заключается в широком использовании радиоактивных методов анализа. В ряде лабораторий при деградации пептидов в секвенаторе применяется радиоактивный или С-ФИТ1Д. Можно вводить радиоактивную метку непосредственно в анализируемый белок. Для многих белков это достигается добавлением радиоактивно меченных аминокислот непосредственно в питательную среду, на которой выращивается культура, являющаяся источником исследуемого белка. Таким же путем оказывается возможным радиоактивно метить белок избирательно по определенным аминокислотным остаткам. Если белок, радиоактивно меченный, например, по остаткам лейцина, анализировать с помощью секвенатора, то простое измерение радиоактивности экстрактов, содержащих анилинотиазолиноны, позволяет безошибочно определить, в каких положениях полипептидной цепи в N-концевой области белка расположены остатки лейцина (рис. 31). Аналогичным образом можно определить положение и других аминокислотных остатков. Такой прием используется для анализа N-koh-цевой последовательности предшественников белков, доступных лишь в ничтожно малых количествах. Для исследования полной структуры он, однако, не применяется из-за дороговизны и трудоемкости. [c.79]

Методы включения метки в З -концевые группы более разнообразны. Так, а двухцепочечные ДНК метка вводится в составе (а- Р1-дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов с помощью ДНК-полимеразы I Е. соИ или фага Т4 (см. с. 348). Двух- и одноцепочечные ДНК могут быть помечены по 3 -концевому звену с использованием концевой нуклеотидилтрансферазы. В одном из вариантов этого метода к З -ОН-группе олигодезоксирибонуклеотида присоединяются а- Р -меченые рибонуклеозидтрифосфаты. После ферментативной реакции продукт подвергается щелочному гидролизу, в результате чего на З -конце образуется только одно рибонуклеотидное звено. Во втором способе используются аналоги природных нук- [c.316]

Введение в З -концевое звено РНК 3, 5 -дифосфатов, меченных Р по 5 -фосфатной группе, может быть осуществлено с помощью РНК лигазы, присоединяющей субстрат к З -ОН-группе. З -Конец РНК может быть маркирован также тритием с помощью химических методов окислением перйодатом и восстановлением бортри-тидом натрия. При этом используется РНК, не содержащая З -фос-фатной группы. [c.317]

Метод неполных специфических химических расщеплений (метод Максама — Гилберта) используется для определения последовательности ДНК. Меченые концевые продукты получают путем специфического расщепления полинуклеотида химическими реагентами по одному из звеньев. Обработка проводится в услоанях неполной статистиче- [c.321]

Проблемой, которую каждый раз приходится решать при использовании метода Максама — Гилберта, является получение полинуклеотидов, меченных только по одному из концов. Обычно для анализа используются двухцепочечные фрагменты ДНК (например, образовавшиеся после расщепления рестриктазами), а все методы введения концевых меток приводят к образованию фрагментоа, меченных по двум 5 - нлн двум 3 -концам. Поэтому приходится прибегать к дополнительным операциям, таким, как разделение комплементарных цепей ДНК после введения метки. [c.325]

ДНК-полимераза I (но не фрагмент Кленова) широко используется для получения меченых ДНК методом так называемой /шк-трансляции (от англ. ni k, обозначающего одноцепочечный разрыве). Если одна нз цепей ДНК содержит одноцепочечный разрыв так, что З -концевой нуклеотид в месте разрыва имеет З -ОН-группу, то ДНК-полимераза 1 в присутствии четырех нук-леозидтрифосфатов осуществляет матричный синтез. Одновременно она гидролизует существовавшую цепь за счет 5 З -экзоиук-леазной активности, как показано на схеме [c.350]

Предварительно метилируя концевые гидроксильные или карбоксильные группы, можно определить степень полимеризации по числу метоксильных групп. Пригодны также методы, основанные на ацилировании гидроксильных групп. Если ацильный остаток содержит галоген, азот или другой элемент, отсутствующий в самом полимере, определение молекулярной массы полимера сводится к элементарному анализу. Эти меченые концевые группы, могут быть введены в макромолекулу во время самого синтеза полимера (полимеризация в присутствии галогензамещенных перекисей, передача цепи при полимеризации в присутствии ССЦ, СНС1з и т. д.). Во всех случаях необходимо пользоваться такими реакциями, в которых участвуют только концевые группы. Нельзя, [c.545]

Кроме классических методов определения молекулярных весов по концевым группам, применяются и иные способы, которые еще пока не нашли широкого распространения, но показывают высокую эффективность. Это в основном применение разных типов меченых атомов, которые тем или иным способом могут быть связаны с концевыми группами макромолекул, а затем определены путем химического анализа, физическими методами или по радиоактивности, если применены активные изотопы. Так, например, Керн и Каммерер [50] проводили полимеризацию метакрилнитрила, метилметакрилата и винилацетата в присутствии перекиси и-бромбензоила, а полимеризацию винилхлорида— в присутствии перекиси Л1-нитробензоила. Из данных химического анализа они установили, что при мягких условиях полимеризации соответствующие бензоильные радикалы входят в макромолекулу. К сожалению, авторы не проводили определения среднечислового молекуляр- юго веса другими абсолютными методами, поэтому не имеется возможности оценить ошибки метода применительно к данным объектам. [c.277]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология