РНК-полимераза модификации

Итак, область эукариотического промотора рассматривается как специфический ДНК-остов, на котором собираются белки транскрипции, узнающие свои сайты связывания и взаимодействующие как друг с другом, так и с РНК-полимеразой. Нельзя исключить, что факторы транскрипции являются ферментами и в процессе этих взаимодействий осуществляются ферментативные модификации как белковых факторов, так и ДНК. Появление нового фактора транскрипции в дифференцированных клетках можно рассматривать как способ включения гена на нужной стадии развития. [c.201]

После начала репликации вирусного генома транскрипция мн -гих (хотя и не всех) ранних генов угнетается и активируется считывание поздних генов. Промоторы поздних н ранних генов различны в частности, первые как будто несколько беднее А-Т-парами, чем вторые. Считают, что поздние промоторы узнаются модифицированной вирус-специфической РНК-полимеразой модификация заключается в том, что в состав этого фермента включается субъединица клеточной РНК-полимеразы П. [c.307]

Система регуляции транскрипции фага Т4 включает также элементы, которые еще не были описаны. В первую очередь следует Назвать ковалентные и нековалентные модификации РНК-полимеразы, а также необходимость синтеза вирусной ДНК для включения поздних генов. [c.297]

В верхней части рисунка стрелками, направленными к двойной спирали, указаны сайты, модификация которых нарушает связывание РНК-полимеразы с ДНК. Сайты, экранируемые ферментом от модификаций, обозначаются стрелками, направленными от двойной спирали. Стрелки, направленные на основание, указывают само модифицированное основание. Стрелки между основаниями обозначают модификацию фосфодиэфирной связи. [c.145]

Продукты некоторых фаговых генов alt и mod) способствуют введению ADP-рибозильных остатков в а-субъединицы РНК-полимеразы. Физиологическое значение такой модификации в точности ие выяснено. На поздних стадиях инфекции наблюдается изменение полипептидного состава очищенных препаратов РНК-полимеразы исчезает а-субъединица (или ее содержание резко падает) и появляются вирус-специфические полипептиды, в частности продукты генов 55 (функциональный аналог а-субъединицы), 33, а также некоторые другие. Полагают, что именно такая измененная, содержащая вирус-специфические субъединицы РНК-полимераза способна узнавать поздние промоторы, структура которых отличается от структуры ранних промоторов как в районе —35 , так и в районе —10 . Но чтобы узнавание поздних промоторов было эффективным, ДНК-матрица должна находиться в компетентном состоянии. Молекулярная природа такого состояния не расшифрована, но ясно, что оно возникает при репликации фаговой ДНК. [c.297]

Общее свойство всех этих модификаций состоит в том, что они дают возможность разорвать соответствующую связь в полинуклеотидной цепи. Такой сайт можно идентифицировать с помощью тех же подходов, которые использовались в экспериментах по определению участков связывания РНК-полимеразы (рис. 11.4). Одну из цепей ДНК метят по концу тогда в результате каждого разрыва образуется фрагмент, который обнаруживается при электрофоретическом анализе как полоса в геле, соответствующая определенному размеру. Используя такой подход, сравнивают чувствительность комплекса РНК-полимераза промотор с чувствительностью свободной ДНК. В результате оказывается, что ряд полос пропадает. Таким путем выявляются участки промотора, экранированные ферментом от модификаций. Интенсивность ряда других полос может усиливаться, выявляя тем самым участки, в которых ДНК должна находиться в более доступной конформации. [c.146]

Особенность участков генов 5S РНК и тРНК, узнаваемых фак4 торами транскрипции и РНК-полимеразой и обеспечивающих инициацию транскрипции, состоит в том, что они локализованы непосредственно в транскрибируемом районе (или районах) гена. Так, район внутри генов 5S РНК лягушки, кодирующий нуклеотиды с 55-го по 80-й, необходим для инициации транскрипции (рис. 114). Размеры транскрипционного комплекса, включающего субъединицы полимеразы, достаточно велики, чтобы взаимодействовать с внутренними районами небольшого по размерам гена и одновременно инициировать транскрипцию. Сигналом терминации транскрипции служит последовательность из нескольких следующих друг за другом тимидиловых нуклеотидов. Роль спейсера в транскрипции, по крайней мере в опытах in vitro, пока не была обнаружена. Новообразованная 5S РНК, по-видимому, не подвергается модификации и процессингу. [c.210]

Синтез. Биосинтез Б. происходит в результате трансляции в субклеточных частицах-рибосолшх, представляющих собой сложный рибо-нуклеопротеидный комплекс. Информация о первичной структуре Б. хранится в соответствующих генах-участках ДНК-в виде последовательности нуклеотидоа В процессе транскрипции эта информация с помощью фермента-ДНК-зависимой РНК-полимеразы - передается на матричную рибонуклеиновую к-ту, к-рая, соединяясь с рибосомой, служит матрицей для синтеза Б. Выходящие из рибосомы синтезированные полипептидные цепи, самопроизвольно сворачиваясь, принимают присущую данному Б. конформацию, а также подвергаются модификации благодаря р-циям разл. функциональных групп аминокислотных остатков и расщеплению пептидных связей (см. Модификация белков). [c.253]

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, программируемый геномом процесс биосинтеза белков и(или) РНК. При синтезе белков Э. г. включает транскрипцию - синтез РНК с участием фермента РНК-полимеразы трансляцию - синтез белка на матричной рибонуклеиновой кислоте, осуществляемый в рибосомах, и (часто) посттрансляционную модификацию белков. Биосинтез РНК включает транскрипцию РНК на матрице ДНК, созревание и сплайсинг. Э. г. определяется регуляторными последовательностями ДНК регуляция осуществляется на всех стадиях процесса. Уровень Э. г. (кол-во синтезируемого белка или РНК) строго регулируется. Для одних генов допустимы вариации, иногда в значит, пределах, в то время как для других генов даже небольшие изменения кол-ва продукта в клетке запрещены. Нек-рые заболевания сопровождаются повышенным уровнем Э.Г. в клетках пораженных тканей, напр, определенных белков, в т. ч. онкогенов при онкологич. заболеваниях, антител при аутоиммунных заболеваниях. [c.413]

Для нормального функционирования аппарата исправления ошибок, связанных с включением неправильных нуклеотидов, необходимо располагать механизмом, позволяющим отличать новосинтезированную цепь ДНК от родительской матричной цепи. В противном случае с вероятностью 1/2 будет происходить исправление нуклеотида в родительской цепи, приводящее к закреплению потенциально мутагенной ошибки, допущенной ДНК-полимеразой. Вероятно, для установления различий между родительской и дочерней цепями ДНК в Е. соИ используется метилирование аденина в последовательности GAT . Эта палиндром-ная последовательность обычно метилирована в обеих цепях родительской ДНК. При полуконсервативной репликации метилированной ДНК образуется дочерняя ДНК, в которой одна цепь, пришедшая от родительской ДНК, метилирована, а новообразованная цепь в течение некоторого времени после выхода из области репликативной вилки остается неметилированной. Следует заметить, что метилирование новообразованной цепи ДНК осуществляется ферментом, отличным от метилаз, входящих в систему рестрикции—модификации, обсуждавшуюся в гл. 9. Бактерии dam , дефектные по метилированию аденина в результате нарушения синтеза соответствующей метилазы характеризуются повышенной частотой спонтанных мутаций, что подтверждает гипотезу об участии метилазы dam в системе исправления ошибок репликации. [c.123]

Как уже говорилось в 1.1 и 2.3, ДНК программирует работу ферментов РНК-полимераз, которые катализируют синтез новых молекул РНК из нуклеотидов с последовательностью, комплементарной одной из цепей программирующей ДНК. Этот процесс называют транскрипцией. Конечным итогом этого процесса является образование информационных, рибосомных, транспортных РНК, а также ряда не очень больших молекул РНК со специальными, далеко не всегда установленными функциями. Образующийся при этом первичный транскрипт в большом числе случаев не является готовой к выполнению своих функций молекулой РНК, а подвергается дополнительной серии превращений, объединяемых общим термином процессинг. Эти превращения могут заключаться в отщеплении от первичного транскрипта определенных блигонуклеотидов с одного или обоих концов, в химической модификации некоторых мономерных звеньев транскрипта, в присоединении, уже без непосредственного участия ДНК, дополнительных остатков нуклеотидов. [c.164]

Рис. 5-6. Старт- и стоп-сигналы для РНК-полимеразы, осуществляющей синтез РНК у Е. соН, Обратите внимание, что матричной цепью служит нижняя цепь ДНК, верхняя же по своей нуклеотидной последовательности соответствует синтезированной РНК (за исключением того, что вместо Т. присутствующего в ДНК. в РНК стоит U). Принято указывать нуклеотидную последовательность применительно к нематричной пени. А. Полимераза начинает синтез у промоторной нуклеотидной последовательности. Считается, что прикрепление полимеразы определяют два коротких участка (выделены красным), отстоящие от начала синтеза РНК приблизительно на 35 и 10 нуклеотидов, вместе с точкой начала синтеза эти последовательности образуют промотор. Сколько-нибудь значительные модификации в любой из них ведут к утрате промоторной активности, изменения в других участках цепи ДНК такого эффекта не вызывают. Б. Полимераза прекращает синтез, после того как будет синтезирован участок из нескольких остатков U (что соответствует нескольким А на матрице) и самокомплементарная нуклеотидная последовательность (выделена серым). Соответствующее сочетание нуклеотидных последовательностей в ДНК служит стоп-сигналом Порядок нуклеотидов в самокомплементарной последовательности может быть различным, решающим для прекращения транскрипции является быстрое образование в

Наряду с химической модификацией для тех же целей люжно использовать ферменты, катализирующие гидролиз нуг<лсиноных кислот. Например, в экспериментах по футпринтингу комплексов ДНК с белками часто используют панкреатическую дезоксирибонуклеазу (ДНКаза I), которая выделяется в пищеварительный тракт млекопитающих поджелудочной яселезой. Этот фермент катализируе г гидролиз внутренних фосфодиэфирных связей в двунитевых и однонитевых ДНК. При кратковременной обработке ДНК этим ферментом, проведенной так, чтобы в среднем на каждую молекулу ДНК пришелся одш разрыв, расщепление приводит к образованию фрагментов самой разнообразной длины, легко регистрируемых с помощью гель-электрофореза. При такой же обработке комплекса ДНК с белком расщепления в участках, экранирован 1ых белковой молекулой, не происходит и фрагменты соответствующей длины на электрофореграмме не обнаруживаются. На рис. 94 в качестве примера приведен результат исследования с помощью футпринтинга фрагмента ДНК с ферментом РНК-полимеразой (см. [c.324]

Последовательности ТАТА и ЦААТ в зоне промотора способствуют правильному расположению РНК-полимеразы на матрице ДНК. Энхансеры, локализованные на значительном удалении от зоны промотора, участвуют в регуляции процесса транскрипции. Сразу после начала транскрипции первый нуклеотид с 5 -конца подвергается модификации (метилированию гуанина), которая называется кэпированием. Поэтому первый нуклеотид, стартовая точка гена, называется кэп-сайт. Сигнал ААТААА (последняя последовательность, кодируемая РНК-полимеразой) способствует блокированию З -конца мРНК. [c.459]

В качестве примера фотоаффинной модификации рассмотрим локализвцию в ДНК-зависимой РНК-полимеразе участков, контактирующих с 5 -коицевой группой синтезируемой РНК. Были отработаны условия, в которых РНК-полимераза способна синтезиро- [c.172]

Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы — субтилизина они применили метод химической мо дификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы химической модификации не только жестки и неспецифичны они плохи еще и тем, что с их помощью невозможно вызвать множественные желаемые изменения, особенно если модифицируемые аминокислотные остатки погружены в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия, основанная на генетической инженерии. Сегодня она осуществляется при помощи двух хорошо освоенных методов (гл. 7). Так, сайт-специфический мутагенез осуществляется следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подх.одящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти — пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов. [c.183]

Первые гены, которые использовались для трансформации растений, были выделены из бактерий, и их нельзя было напрямую использовать для трансформации растительных клеток. Для того чтобы бактериальные гены транскрибировались в эукариотической клетке необходимо заменить их исходные бактериальные промоторные последовательности либо на промоторы растительных генов, либо на другие, которые могут инициировать транскрипцию в растительной клетке. Кроме того, необходимо присоединить к З -последовательности бактериального гена фрагмент, содержащий сигнал полиаденилирования. Такие модификации необходимы для того, чтобы эукариотическая РНК-полимераза могла транскрибировать бактериальную последовательность, и затем мРНК транслировала бактериальный белок в растительной клетке. [c.63]

В настоящее время эта точка зрения хотя и не опровергнута, но уже не кажется столь вероятной. В клетках Е. соИ пока не обнаружено гетерогенности о-поли-пептида, а опыты по выделению о-подобного полипептида, индуцированного фагом Т4, воспроизвести не удалось. Оказалось, напротив, что при инфекции фагом Т4 происходит модификация а- и Р-субъединиц РНК-полимеразы клетки-хозяина. Функциональное значение этой модификации пока неясно. Четко установлено, что в случае фагов ТЗ и Т7 использование особого типа стартовых точек, функционирующих во второй половине инфекционного периода, осуществляется не за счет появления нового о-по-липептида, а за счет появления совершенно новой РНК-полимеразы, кодируемой геномом фага. Эта полимераза в отличие от РНК полимеразы Е. ali состоит всего из одного полипептида.— Прим. перев. [c.404]

Эксперимент с использованием метилирующего агента ДМС может быть проведен в обратном порядке. Сначала можно прометилировать ДНК, а затем воздействовать на нее РНК-полимеразой. При этом образуется набор молекул ДНК, метилированных в некоторых, но не во всех возможных положениях. Те молекулы ДНК, которые не смогли провзаимодействовать с РНК-полимеразой, подвергаются обычной обработке. В результате образуются фрагменты, размеры которых при электрофоретическом разделении соответствуют местам разрывов. Это дает возможность локализовать те точки, в которых предшествующая модификация предотвращает связывание РНК-полимеразы с ДНК. Аналогичные эксперименты можно осуществить, проводя алкилирование фос-фодиэфирного каркаса ДНК. [c.146]

Обычно фаговые гены детерминируют функции, обеспечивающие предпочтительную репликацию фаговой ДНК. Эти функции могут быть связаны с инициированием репликации или даже с обеспечением клетки новой ДНК-полимеразой. Некоторые изменения всегда вносятся в способность клетки-хозяина осуществлять транскрипцию. Они могут выражаться в замещении РНК-полимеразы или модификации ее способности инициировать или терминировать процесс транскрипции. Результат всегда один и тот же транскрибируется предпочтительно фаговая мРНК. Что касается белкового синтеза, обычно фаг удовлетворяется использованием аппарата клетки-хозяина, изменяя его активность в основном путем замещения бактериальной мРНК на фаговую мРНК. [c.206]

Почему митохондриям и хлоропластам необходима собственная генетическая система, тогда как другие органеллы, например пероксисомы и лизосомы, ее не имеют Этот вопрос совсем не тривиален, так как поддержание отдельной генетической системы дорого обходится клетке специально для этих целей в ядерном геноме должно быть закодировано более 90 белков, в том числе много рибосомных белков, аминоациал-тРПК-синтетазы, ДНК- и РНК-полимеразы, ферменты процессинга и модификации РНК (рис. 7-75). Большинство изученных белков из митохондрий и хлоропластов отличаются по аминокислотной последовательности от своих аналогов из других частей клетки, и есть основание полагать, что в этих органеллах сравнительно мало таких белков, которые могли бы встретиться еще где-нибудь. Это означает, что только для поддержания генетической системы каждого вида энергетических органелл в ядерном геноме должно быть не менее 90 дополнительных генов. Причины такого расточительства неясны, и надежда на то, что разгадка будет найдена в нуклеотидных последовательностях митохондриальной ДНК, не оправдалась. Трудно представить себе, почему образующиеся в митохондриях белки должны непременно синтезироваться там. а не в цитозоле. [c.500]

РНК-полимераза, фермент, катализирующий транскрипцию ДНК, представляет собой сложную молекулу, состоящую из многих полипептидных цепей. В эукариотических клетках обнаружено три РНК-полимеразы 1,11 и 111. Эти ферменты эволюционно связаны друг с другом и с бактериальной РНК-полимеразой, у них имеются одинаковые субъединицы. По-видимому, после инициации транскрипции от каждого фермента отделяются одна ти несколько субъединиц, называемых факторами инициации. Вместо них к ферментам присоединяются субъединицы, называемые факторами элонгации. Они необходимы для удлинения цепи РНК, ее терминации и модификации. Вероятно, факторы элонгации у различных типов полимераз разные, именно этим можно объяснить, почему транскрипты, синтезируемые каждым ферментом, модифицируются по-разному. [c.170]

Высокоспецифичные протеиназы играют важную роль в регуляции клеточного цикла, в частности при переходе от вегетативного роста к образованию спор у дрожжей и бактерий. У мутантов дрожжей с низким уровнем протеиназ А и В снижена способность к споруляции. Выделен температурно-чувствительный мутант по споруляции Вас. subtilis, у которого этот дефект связан с повреждением структурного гена для внутриклеточной протеиназы. У Вас. thuringiensis с началом спорообразования специфическая протеиназа расщепляет -субъединицу РНК-полимеразы, осуществляя необходимую модификацию фермента. [c.56]

Спустя несколько минут после проникновения бактериофага в клетку Е. oli генетический аппарат бактерии переключается с транскрипции собственного генома на транскрипцию фага Т4 . при этом используется РНК-полимераза Е. соИ. В этом процессе участвуют две разные реакции ADP-рибо илирования, получившие названия реакции альтерации, и реакции модификации [51]. [c.130]

ЦИИ завершается в течение первой минуты от начала заражения при этом ADP-рибозилированию подвергается не более 50% а-субъединиц. Следует отметить также, что ADP-рибозилирование -, - и а-субъединиц обратимо (через несколько минут после заражения эти субъединицы оказываются интактными). Значение реакции альтерации остается неясным,-тай как мутанты фага, лишенные ADP-рибозилтрансферазы, сохраняют способность репродуцироваться в клетках [51]. Реакция модификации влияет на синтез белка в зараженной клетке она осуществляется через несколько минут после реакции альтерации. В результате реакции модификации происходит количественное ADP-рибозилирование определенного остатка аргинина в а-субъединице [52] вероятно, именно поэтому полимераза перестает транскрибировать геном Е. oli, но сохраняет при этом способность к транскрипции генов фага Т4. Можно полагать, что а-субъединицам принадлежит важная роль во взаимодействии полимеразы с промоторными участками генома Е. соН [53]. Реакции альтерации и модификации катализируются различными ферментами, так как мутации, затрагивающие эти функции, локализуются в различных участках генома фага [54]. [c.131]

Регуляторные части генов, а также продукты их экспрессии, мРНК и белки, распознаются соответствующими ферментными системами организма и обеспечивают упорядоченную экспрессию структурной части гена. При этом регуляторные участки генов и промежуточных продуктов их экспрессии, как правило, высокоспецифичны в отношении своих природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего они не могут эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. Очевидно, что при конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген будет экспрессироваться. Однако не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для высокоэффективной экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Как уже было отмечено, структурные части генов про- и эукариот фундаментально отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов интронов. Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в бактериальных клетках, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3 - и 5 -концевых некодирующих последовательностей. Даже такой [c.106]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология