Внутриклеточная протеиназа

Различают экстенсивную и интенсивную регуляцию активности ферментов в клетках и тканях организма. Экстенсивная регуляция обусловлена индукцией или репрессией генов, кодирующих синтез соответствующих ферментов. Увеличение или уменьшение числа активных молекул определяет суммарную активность пула данного фермента в каком-либо компартменте клетки, в ткани или целом органе. В физиологических условиях содержание того или иного фермента в клетке постоянно и регулируется двумя процессами скоростью его синтеза и распада. Оба эти процесса взаимосвязаны и контролируются на генном уровне. Увеличение скорости синтеза ферментативного белка обусловливает активацию внутриклеточных протеиназ и ускоренный распад старых молекул фермента, а снижение скорости синтеза приводит к замедлению распада ферментативного белка. [c.80]

Обычно такие реакции переноса протекают с наибольшей скоростью при рН7—8, а гидролиз — при pH около 5. В связи с этим высказано предположение, что основная функция внутриклеточных протеиназ в физиологической зоне pH состоит з катализе реакций переноса. [c.264]

Считали также, что пепсин действует на белковые катионы, а трипсин— на анионы. Оказалось, что заряд субстрата не играет существенной роли химотрипсин, например, совсем не нуждается в ионизированном субстрате. Внутриклеточные протеиназы (папаин, катепсин) проявляют активность к значительно большему числу субстратов, чем протеиназы желудочно-кишечного тракта. [c.345]

Зазор между стеклянной стенкой и тефлоновым пестиком ручного гомогенизатора должен быть в пределах 0,35—0,70 мм. Механический гомогенизатор можно охлаждать в воде со льдом для поддержания низкой температуры при разрушении клеток (в этом случае резко снижается активность внутриклеточных протеиназ) или проводить эксперимент в холодной комнате. Степень разрушения контролируют в фазово -контрастном микроскопе или по белку, высвобожденному из клеток. [c.134]

Известно несколько различных семейств протеиназ, причем не все они обязательно содержат в активном центре серин. В одно из семейств входит пепсин желудка и родственные ферменты, например реннин из четвертого желудка (сычуга) теленка. Реннин вызывает быстрое свертывание молока и широко применяется в сыроварении. К этому же семейству относятся некоторые внутриклеточные катепсины и протеиназы различных грибов. Необычным свойством пепсинового семейства протеиназ является то, что они наиболее активны в интервале pH от 1 до 5. Это свойство делает понятным, почему серин и гистидин не входят в состав активного центра этих ферментов. Считают, что у кислых протеиназ в механизме двойного замещения роль нуклеофила выполняет карбоксилат-ион, а донором протона по отношению к уходящей группе служит вторая карбоксильная группа. Таким образом, механизм действия пепсина подобен механизму действия лизоцима. [c.113]

Установлено, что множественные мутанты по пептидазам в процессе роста на минимальных средах накапливают гетерогенную смесь небольших пептидов, которые образуются из внутриклеточных белков под действием протеиназ. В настоящее время не известно, как осуществляется регуляция действия пептидаз и как она связана с активностью ферментов, осуществляющих начальные этапы деградации белков. Но такая связь, вероятно, существует, на что указывает замедленное разрушение аномальных белков, содержащих аналоги аминокислот, в клетках мутантов, дефектных по пептидазам. [c.57]

КАТЕПСИНЫ, ферменты класса гидролаз внутриклеточные протеиназы. Играют важную роль в катаболизме белков катализируют гидролиз белков и пептидов в слабокислой среде. Для формы А из мышц карпа (мол. м. 34 ООО) оптнм. каталитич. активность при pH 4,6—5,8 обладает пептидазной активностью и гидролизует эфиры и амиды [c.249]

Тканевые протеиназы локализованы в основном в лизосомах, содержащих большой набор активных гидролаз, в том числе кислых протеиназ. Внутриклеточные протеиназы, гидролизующие белки в слабокислой области pH, называют катепсинами. В настоящее время различают пять достаточно хорошо охарактеризованных типов катепсинов, которые обозначают буквами А, В, С, D, Е. Они отличаются оптимумом pH, субстратной специфичностью и рядом других свойств. [c.369]

Белки, входящие в состав клеток организма, также подвергаются постоянному распаду под влиянием внутриклеточных протеолитических ферментов, называемых внутриклеточными протеиназами или катепсинами. Эти ферменты локализованы в специальных внутриклеточных органоидах - лизосомах. Под действием катепсинов белки организма также превращаются в аминокислоты. (Важно отметить, что распад как пищевых, так и собственных белков организма приводит к образованию одних и тех же 20 видов аминокислот.) В сутки расщепляется примерно 200 г белков организма. Поэтому в течение суток в организме появляется около 300 г свободных аминокислот. [c.69]

Высокоспецифичные протеиназы играют важную роль в регуляции клеточного цикла, в частности при переходе от вегетативного роста к образованию спор у дрожжей и бактерий. У мутантов дрожжей с низким уровнем протеиназ А и В снижена способность к споруляции. Выделен температурно-чувствительный мутант по споруляции Вас. subtilis, у которого этот дефект связан с повреждением структурного гена для внутриклеточной протеиназы. У Вас. thuringiensis с началом спорообразования специфическая протеиназа расщепляет -субъединицу РНК-полимеразы, осуществляя необходимую модификацию фермента. [c.56]

Эффективность системы экспрессии, основанной на клетках OS, зависит, в первую очередь, от природы рекомбинантного белка, которая определяет его чувствительность к внутриклеточным протеиназам, а также метода трансфекции, соотношения числа клеток и молекул рекомбинантных плазмид, используемых для трансфекции, и состава питательной среды. Пример экспрессирующей кассеты генов, используемой в этой системе, представлен на рис. 17, а. Такой фрагмент ДНК может быть интегрирован в подходящую коммерческую плазмиду, в частности, в экспрессирующий вектор рХМТЗ. [c.181]

В то время как некоторые протеиназы, расщепляющие внутриклеточные белки, по всей вероятности, находятся в цитоплазме, катепсины, имеющие оптимум pH в кислой области, располагаются в лизосомах [31, 32], а в пероксисомах обнаружена нейтральная протеиназа. Катеп- [c.94]

Коллаген [30]—волокнистый белок, содержащийся в коже, сухожилиях, хрящах, костях и зубах. Коллаген внутриклеточно синтезируется в фибробластах в виде предшественника, проколлагена с м. м. цепи 125 000—130000. Его отличие от коллагена заключается в продлении jV-концевого сегмента, содержащего дисульфидные связи н триптофан. Превращение проколлагена в коллаген осуществляется вне клетки ферментом проколлагенпептидазой, удаляющей содержащий цистин и триптофан iV-концевой сегмент посредством расщепления связи X-Glu или X-Gln, в результате чего на N-конце коллагена образуется остаток пирролидон-2-карбо-новой-5 кислоты. Об этой протеазе известно мало, за исключением того, что она содержит важный для активности металл и не является ни сериновой , ни тиольной протеиназой. Наследственное заболевание крупного рогатого скота, дерматоспараксис, объясняется отсутствием этой протеолитической стадии. Коллаген состоит из трех полипептидных цепей, в каждой из которых содержится около 1000 аминокислотных остатков. Цепи образуют тройную правую спираль, причем на каждый третий остаток приходится одна межмолекулярная водородная связь >NH. .. 0=С<. У N- и С-концов коллагена расположены неспиральные телопептидные участки. Зрелый коллаген содержит два типа цепей, al и а.2, образуя в тройной спирали структуру состава (а1)га2. В эмбриональном коллагене, а также в коллагене, образующемся на ранних стадиях заживления раны, содержится только один тип цепей (а1)з. [c.573]

Еще сравнительно недавно протеиназы традиционно связывали только с процессами переваривания. В настоящее время появляется все больше данных о более широкой биологической роли протеолитических ферментов органов и тканей в регуляции ряда вне- и внутриклеточных процессов. Некоторые протеиназы выполняют защитную функцию (свертывание крови, система комплемента, лизис клеток), другие генерируют гормоны, токсины, вазоактивные агенты (ангиотензин, кинины). Ряд протеиназ регулирует образование пищеварительных ферментов, взаимодействие между клетками и клеточными поверхностями, процессы фертилизации (хитин-синтетаза) и дифференциации. Регуляция в большинстве случаев предусматривает превращение неактивного предшественника в активный белок путем отщепления ограниченного числа пептидов. Этот процесс, впервые описанный К. Линдерстрем-Лангом еще в 50-е годы, в последнее время называют ограниченным протеолизом. Значение его очень важно для понимания сущности биологического синтеза в клетках неактивных пре-и пробелков. Кроме того, этот процесс нашел широкое практическое применение в лабораториях и промышленности. В регуляции действия протеолитических ферментов участвуют также ингибиторы протеиназ белковой природы, открытые не только в поджелудочной железе, но и в плазме крови, курином яйце и т.д. [c.423]

Лизосомы также ограничены однослойной мембраной. Матрикс их оптически неоднороден и содержит ряд уплотнений. В лизосомах локализован набор гидролитических ферментов, участвующих в разрушении продуктов клеточного метаболизма, причем при помощи специального протонного насоса поддерживается низкое значение pH (не более 4,5), способствующее эффективному гидролизу. Внутриклеточные структуры, подлежащие разрушению, поступают в лизосомы, где и подвергаются гидролизу. Процесс селекции и поступления в лизосомы только отработанного материала обусловлен его специфическим мечением. Так, нативные белки в лизосомы не поступают. По истечении же времени функционирования происходит их инактивация цитоплазматическими протеиназами или присоединение убиквитина, что является сигналом для транспорта в лизосомы модифицирбванного белка. Кроме молекул, лизосомы могут разрушать органеллы или целые клетки (митохондрии, эритроциты). Процесс транспорта веществ в лизосомы является энергозависимым и требует затраты энергии. В растительных клетках гидролитические ферменты обычно локализованы в вакуолях — прообразе лизосом. [c.13]

Хольцер [2012] описал несколько протеиназ дрожжей, различающихся по специфичности и механизму действия и, по-видимому, ответственных за внутриклеточную деградацию белков. Были обнаружены пептиды, которые специфически ингибируют эти три фермента [2013]. Указанные протеиназы локализованы в вакуолях и, следовательно, изолированы от своих субстратов. Контроль процессов деградации би,лка может осуществляться в этом случае путем изменения кондентрации ингибиторов протеиназы (через изменение скорости их синтеза или распада) или самих протеиназ. В регуляции времени полуобновления ферментов эти эффекты следует рассматривать как дополнительные к способности субстрата подвергаться превращениям и компартментализации фермента и субстрата. [c.117]

Недавно Надлер и др. [102] на основании гистологических и радио-автографических исследований щитовидной железы крысы после разовой инъекции ТСГ сделали выводы, которые, видимо, могут разрешить этот вопрос. Подсчет коллоидальных капелек в трех отделах клеток показал, что они появляются сначала в токах цитоплазмы, затем вблизи апикальных отделов и, наконец, вблизи базальных отделов клеток. Эти данные были подтверждены результатами радиоавтографии после введения крысам вместе с ТСГ [Н ]-лейцина [103]. Протеолиз, осуществляемый внутриклеточными ферментами, мояшо рассматривать как процесс, локализованный исключительно внутри клеток посредством действия на коллоидные капельки, которые попадают в клетки из просвета фолликула. Однако, принимая во внимание более ранние наблюдения Де Робертиса [104], обнаружившего, что в коллоиде просвета фолликула вместе с тиреоглобулином содержится протеиназа (активная в кислой среде), авторы [102] выдвинули предположение. [c.229]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Протеинкиназа С подвергается аутофосфорилированию в присутствии Са и фосфолипидов. Физиологическое значение этого процесса состоит, вероятно, в повышении активности киназы. Установлена также активация протеинкиназы С офаниченным протеолизом под действием мембраносвязанной Са-активируемой эндогенной протеазы. Полученные фрагменты теряют сродство к мембранам независимо от присутствия Са и диацилглицерина. Такие растворимые фрагменты С-киназы, активность которых не зависит от Са и фосфолипидов, появляются при взаимодействии форболовых эфиров с некоторыми клетками. Ингибиторы Са-зависимых протеиназ (калпайнов) блокируют это действие форболовых эфиров. Очевидно, при стимуляции рецепторов фосфолипазы С увеличение внутриклеточной концентрации ионизированного Са " " под действием инозитолтрифосфата приводит наряду с транслокацией С-киназы на мембраны также к активации мембраносвязанных, Са-стимулируемых протеиназ и появлению независимой от Са " и фосфолипидов активности С-киназы. [c.359]

Альтернативный способ защиты эритроцита от кальциевой перегрузки (К. К. Wang et al., 1988) связан с активацией Са-АТФазы внутриклеточной Са-зависимой протеиназой — каль-паином. Данный механизм может реализовываться в крайних ситуациях, когда концентрация Са + в клетке существенно превышает 10 М. При такой необратимой модификации фермент утрачивает способность к регуляции под действием кальмодулина. [c.49]

Детальный механизм тромбообразования полностью еще не установлен. Показано, однако, что различные агонисты, т. е. вещества-активаторы тромбоцитов, взаимодействуют на мембране этих клеток со специфическими рецепторами. Например, тромбин — последняя протеиназа в каскадном процессе коагуляции крови, действует уже при чрезвычайно низких концентрациях— от 1 до 5 мкмоль/л. Он расщепляет на клеточной мембране единственный поверхностный гликопротеин. Хотя другие гликопротеины ингибируют активность тромбина, некоторые из них тем не менее необходимы для функции тромбоцитов, в частности для формирования фибриногенсвязываю-щих участков. В последние годы установлено, что активация тромбоцитов связана с фосфорилированием двух внутриклеточных белков по двум различным механизмам легкой цепи миозина с молекулярной массой 20 кД (Са-кальмодулинзави-симое фосфорилирование) и белка с молекулярной массой около 40 кЛ (Са-фосфатидилсеринзависимое фосфорилирование). [c.94]

Замечательным свойством GFP является его полная функциональная независимость от каких-либо дополнительных кофакторов. Кроме того, белок мало токсичен для клеток, легко обнаруживается и его внутриклеточное содержание можно оценивать количественно с высокой точностью. GFP стабилен при значениях pH 5-12, устойчив к действию протеиназ и высоких температур (вплоть до 65 С), не инактивируется в присутствии детергентов (1% SDS), 6М хлористого гуанидина, а также в препаратах, фиксированных формальдегидом. При этом флуорофор практически не обесцвечивается в процессе флуоресцентной микроскопии. Из-за небольшого размера GFP оказывает минимальное влияние на подвижность и локализацию гибридного белка-партнера, что делает особенно удобным его использование в генно- [c.388]

Протеиназы, присутствующие в прорастающих семенах, органоспецифичны. Предполагается существование механизма регуляции, обеспечивающего их своевременное действие. Кроме того, видимо, есть протеиназы, активирующие некоторые другие гидролитические ферменты, а также протеиназы, участвующие в обычном кругообороте внутриклеточных белков. Из множества протеолитических ферментов в семенах лишь некоторые участвуют в процессе гидролиза запасных белков прн прорастании, [c.180]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология