Электрофорез очистка белков

Электрофорез. Как указывалось выше, зонный электрофорез белковых смесей с использованием емкого носителя, обычно крахмальных блоков, обладает исключительно высокой разрешающей способностью и позволяет почти количественно выделить нужный белок. Эта особенность метода зонного электрофореза делает его исключительно эффективным при решении проблемы очистки белков. [c.80]

На конечных стадиях очистки ферментов часто используется электрофорез. Это — физический метод, в основе которого лежит различная скорость движения отдельных белков в электрическом поле, определяемая величиной свободного заряда их молекул. Так как количественные соотношения положительно и отрицательно заряженных групп в белках неодинаковы, то различия в их свободном (суммарном) заряде могут служить основой для электрофоретического разделения белковых смесей. Когда белок находится в изоэлектрическом состоянии, т. е. его суммарный отрицательный заряд равен положительному, то в электрическом поле он неподвижен. При различных pH среды он может двигаться либо к аноду, либо к катоду, причем с неодинаковой скоростью. [c.154]

В сравнении с хроматографическими методами все другие способы очистки белков за последние годы начинают несколько отступать на задний план. Все же следует упомянуть здесь о препаративном электрофорезе, который применяется довольно широко в разных исполнениях. Для фракционирования малых весовых количеств белков разделение смеси белков на зоны ведут в том или ином стабилизирующем наполнителе для ликвидации конвекционного перемешивания. Пригодными наполнителями являются волокна целлюлозы, в частности бумага. Бумажный электрофорез белков похож на разделение аминокислот и пептидов на бумаге, о чем мы уже говорили выше. Другой широко употребительной средой является гель крахмала, который разрезается на кусочки после завершения электрофореза, и из каждого куска элюируется содержащийся в нем белок. [c.131]

Препаративный электрофорез в акриламидном геле может быть использован на любой стадии очистки гибридного белка для его выделения в качестве неповрежденного, но денатурированного иммуногена. ДСН-лизаты клеток, полученные, как описано выше в разд. 5.3.2, после осветления центрифугированием могут быть непосредственно нанесены на гель. Белок примерно из 15 мл клеток, лизированных в 1,25 мл буфера для нанесения, содержащего 1,5% ДСН, можно исследовать, используя одну пластину геля с площадью поперечного сечения 2,0 см . [c.155]

Рассмотренный только что для обычной сефарозы, этот вариант элюции, естественно, находит применение и при использовании гидрофобизированной агарозы. В качестве примера процитируем недавно опубликованную работу по мягкой очистке HMG-белка из ядер печени на колонке со-аминобутилагарозы. Этот белок растворим в растворе сульфата аммония вплоть до концентрации, достигающей 70% от насыщения. Сначала такой концентрацией СА в нейтральном 0,01 М трис-буфере высаливали из экстракта ядер большое количество балластного белка. Затем надосадочную жидкость, содержащую около 40 мг белка, вносили на колонку размером 2 X X 30 см, уравновешенную тем же раствором СА. Элюцию вели снижающимся линейным градиентом концентрации СА в том же буфере (500 мл) со скоростью 20 мл/ч, т. е. примерно 7 мл/см -ч. Низкая скорость элюции характерна для всех опытов такого рода ввиду повышенной вязкости концентрированных солевых растворов и соответствующего снижения скорости диффузии макромолекул. Около 30% белка не садилось на колонку и удалялось при первоначальной промывке. В ходе элюции выходило четыре пика, в первом из которых методом электрофореза идентифицировали HMG-белок [ onner. omings, 1981]. [c.181]

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фоьсусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в ввде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая [c.32]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

В зависимости от способа вьщеления может быть выявлено различное количество фракций и подфракций этого белка, что отражает как его природную гетерогенность, так и различные артефакты, связанные с методами вьщеления. Например, при электрофорезе с использованием высокой концентрации ПААГ обнаруживалось 5 фракций, причем все они реагировали с антисывороткой к белку S-100. На сефадексе G-100 белок S-100 может быть разделен также на 5 фракций, обозначаемых как fj, I2> U 5 причем до 85% этого белка приходится на долю первой фракции. Последующие стадии очистки приводят к разделению этой первой фракции на подфракции f д, fjg, fjrl основная масса белка была сосредоточена в последней подфракции, молекулярная масса которой составляла 19-22 кД. Кроме указанных субфракций в эту же группу включают в настоящее время еще около десятка родственных белков, содержание которых относительно невелико. [c.72]

Градиент pH используется не только в диск-электрофорезе, но и при электрофорезе с достижением изоэлектрической точки. (Изоэлектрическая точка — значение pH, при котором амфолит (молекулы, содержащие катионные и анионные группы, например, белок) теряет заряд и в электрическом поле не движется.) Если смесь белков разделять электрофоретически в градиенте pH, то каждый белок будет двигаться до достижения своей изоэлектрической точки. В результате отдельные белки как бы сфокусированы в отдельных зонах. Поэтому этот метод еще носит название изоэлектрической фокусировки. Он используется не только в аналитических, но и в препаративных целях. Особенно часто он применяется на первых этапах очистки белков, так как позволяет быстро и с высоким разрешением фракционировать довольно большие (граммы) количества образца. [c.114]

Агрегацию, а следовательно, и осаяадение белковых молекул можно вызвать добавлением к раствору белка солей, например сульфата аммония. Молекулы белка и неорганические ионы при гидратации конкурируют за молекулы воды, и по достижении определенной концентрации соли взаимодействия белок — белок начинают преобладать над взаимодействиями белок — вода, что приводит к агрегации, а затем и осаждению белка. Этот метод широко применяется на начальных стадиях очистки белков. Различия в изоэлектрической точке разных белковых молекул используются при разделении белков с помощью электрофореза. [c.24]

Для ЭТОГО предложено почти полтора десятка методов. Белок признают гомогенным, если увеличение его количества в твердой фазе не сопровождается возрастанием содержания белка в растворе (рис. 14). Наличие одной белковой полосы при электрофорезе в полиакрила-мдцном геле, одного пика на выходной кривой (либо одной белковой зоны на пластинке) при хроматографировании или гельфильтрации, резкой границы пограничного слоя белок—растворитель при ультрацентрифугировании белка являются наиболее надежными показателями гомогенности белкового препарата. В большинстве случаев гомогенны кристаллические белки. Если кривая распределения белковых частиц по высоте при использовании метода свободной диффузии подчиняется теоретической кривой распределения Гаусса, белок гомогенен. Достижение в процессе очистки белка стабильного содержания свободных Н8-групп или содержания радиоактивной метки (при работе с меченым белком), равно как и постоянного уровня биологической (ф мен-тативной, гормональной и т. п.) активности, свидетельствует в пользу гомогенности белка. Выявление единственной N-кoнцeвoй и единственной С-кон-цевой аминокислоты при анализе белкового препарата также является признаком гомогенности выделенного белка. [c.34]

Предположим, что вы выделили белок, обладающий двумя ферментативными активностями. Исходя из этого, вы предполагаете, что при очистке получилось два белка. Для проверки этого вы подвергли препарат электрофорезу в полиакриламидном геле при- различных значениях pH. В каждом случае получалась единственная зона, однако более широкая, чем обычно , поэтому вы предположили, что она в действительности представляет собой две неразрешенные зоны. В ДСН-геле также получается одна широкая зона. Поскольку белки с двумя ферментативными активностями встречаются редко, следует внимательнее посмотреть, не является ли большая ширина зоны результатом наложения двух зон. Какие параметры вы можете варьировать для улучшения разрешения электрофореза Какие другие неэлектрофорети ческие методы могли бы здесь помочь [c.246]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология