Гель-электрофорез белков

Особой формой гелЬ Электрофореза является барьерный электрофорез [1335] (рис. 24). Белковый раствор заливают в пространство 6 между двумя слоями геля ( ) и подвергают электрофорезу. При этом в результате смешивания гелей с разными величинами электроосмоса или путем введения в полиакриламидный гель дополнительных зарядов [1064] регулируют электроосмос так, чтобы он полностью компенсировал миграцию выделяемого белкового компонента. Тогда этот белок будет оставаться в пространстве 6, в то время как другие компоненты смеси переместятся сквозь гель в отсеки 5 и 7. [c.67]

Разделение при гель-электрофорезе происходит как по зарядам, так и по размерам молекул. Гель можно приготовить таким образом, чтобы он имел размеры пор, подходящие для данной группы разделяемых белков. Важнейшее преимущество гелей— это их стабилизирующее действие, проявляющееся в снижении до минимума конвекционной и диффузионной подвижности белков. Поэтому белковая полоса остается узкой все время, пока белок движется через гель, и это приводит к тому, что до- [c.216]

Это четвертый электрофоретический метод, который также широко используется в настоящее время. Он сходен с гель-электрофорезом в присутствии ДСН в том отношении, что белки в данном случае также разделяются только в соответствии с их размерами, а не по величине зарядов 182]. Концентрация акриламида изменяется по длине пластинки от самого высокого значения (обычно около 30%) в нижней ее части до всего лишь 3% в верхней. Буфер выбирается с высоким значением pH, так что в большинстве своем белки мигрируют в геле к аноду (вниз). Электрофорез длится до тех пор, пока каждый белок не достигнет такого участка в геле, где из-за слишком малых размеров пор он уже не сможет двигаться дальше. Например, небольшие белки могут дойти до участка, содержащего 25% акриламида, а крупные останутся вблизи старта (верхняя часть геля). Как и в системе с ДСН, при электрофорезе в градиентном геле можно определить размеры молекул, если прокалибровать гель с помощью смеси стандартных белков. Однако в данном случае эти размеры будут относиться к нативным белкам, а не к их субъединицам. Система электрофореза в градиентном геле сходна со следующим, пятым методом — изоэлектрическим фокусированием процесс продолжается до тех пор, пока не прекратится перемещение всех белков и пока не завершится фокусирование , или концентрирование, диффузных белковых зон, в результате чего будет достигнута очень высокая степень разрешения. [c.323]

Представляя для печати результаты, полученные при определении чистоты ферментного препарата с помощью гель-электрофореза, важно дать какую-то количественную оценку содержания всех присутствующих в нем примесей. Заявление, что образец дал одну полосу при электрофорезе , неубедительно, если количество нанесенного на гель белка было настолько мало, что получилась только одна слабо окрашенная зона. Желательно также представить какое-то подтверждение того, что окрашенная полоса — это действительно данный фермент, а не присутствующий в препарате другой белок, который в количественном отношении даже превосходит исследуемый фермент. В литературе часто встречаются примеры того, как совершенно ошибочно основная полоса, полученная при электрофорезе, без всяких доказательств приписывается очищенному ферменту, хотя на самом деле она относится к примеси. Если удельная активность выделенного препарата слишком низка, то количество данного фермента в нем может составлять всего лишь 1% общего содержания белка, и при гель-электрофорезе его вряд ли можно заметить. В этом случае могут помочь фотографии электрофореграмм, хотя на них обычно плохо воспроизводится картина распределения окраски по относительной интенсивности. Более надежные в этом смысле результаты дает сканирование окрашенного геля (рис. 9.7). При этом единственная оговорка, которую можно сделать, касается относительной интенсивности специфической окраски различных обнаруженных компонентов. Исходя из предположения, что все белки окрашиваются одинаково, можно произвести точное количественное определение всех компонентов, используя гель-сканирующее устройство. [c.329]

Методы выделения РНК (обзоры — см. в общем, довольно близки к методам выделения ДНК. Экстракцию клеток или субклеточных частиц для получения РНК проводят обычно фенолом остаточный белок часто удаляют обработкой детергентом или смесью хлороформа с октиловым спиртом. Отделение ДНК от РНК происходит обычно на стадии экстракции, так как можно подобрать условия, в которых РНК переходит в водный слой, а ДНК остается в интерфазе. Часто применяют для этой цели фракционное осаждение, реже — обработку препарата ДНК-азой. Различные типы клеточной РНК могут быть разделены фракционным осаждением, центрифугированием в градиенте плотности сахарозы методами хроматографии и электрофореза в геле [c.36]

По окончании электрофореза под гель вдвигают тонкую стеклянную пластинку и разрезают гель продольно на ломтики одним взмахом тонкой стальной проволоки соответствующей длины. Зоны, содержащие белок, окрашивают амидовым черным 10В или нигрозином в растворе метанол—вода—уксусная кислота (50 50 10) и гель тщательно промывают тем же растворителем. Можно использовать также красители на жире. [c.257]

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фоьсусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в ввде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая [c.32]

Первая стадия опре51 еления строения белка состоит в идентификации и количественном определении составляющих его аминокислот. Для этого требуется образец чистого белка, что само по себе представляет значительную проблему. Чтобы получить чистый образец, обычно применяют комбинацию методов (гл. 3), таких, как гель-электрофорез, ионообменная хроматография и центрифугирование по градиенту плотности (белки с большей молекулярной массой оседают быстрее, чем белки с меньшей молекулярной массой). Когда белок в результате применения этих методов становится однородным или когда достигнут максимум биологической активности, белок считается чистым. Тогда его гидролизуют до составляющих аминокислот горячей соляной кислотой и гидролизат анализируют. [c.267]

Хорошо известно, что при разделении белков с помощью диск-электрофореза в одной полосе не всегда -содержится только один белок, т. е. разделение сложных смесей может быть неполным. Наиболее эффективный подход предусматривает две стратегии разделения на основе различий в размерах молекул и в значениях р1. Например, образец можно вначале подвергнуть изо-электрическому фокусированию в полиакриламидном геле. Затем гель извлекают из трубки или (если электрофорез проводился на пластине) вырезают узкую полоску геля. Эту полоску помещают у верхнего края новой пластины геля в том месте, где обычно делают канавки для образцов, и закрепляют ее растопленным агаром. Проводят второй этап разделения — гель-электрофорез в присутствии ДСН, после чего гель окрашивают. Пример особенно эффективного разделения белков этим методом описан О Фарреллом [77], которому удалось обнаружить 1000 белков в экстракте клеток Es heri hia oli. [c.278]

Секретированная форма НА оказывается отличной от белка связывания мембраны дикого типа только в одном отношении — в скорости его гликозилирования. Добавка углевода к белкам происходит в две стадии. Как только образующийся белок появляется на открытой просвету потока стороне грубого эндоплазматического ретикулума, преформированные богатые сахарозой олигосахариды переносятся от липидного носителя к определенным аспарагиновым остаткам [13, 21]. Это первоначальное котрансляционное гли-козилирование кора является только первым шагом в тщательно разработанной программе реакций, которые происходят в грубом эндоплазматическом ретикулуме и позднее в аппарате Гольджи, где сахара упорядочены и добавлены к образующемуся белку [13, 26]. Во время биосинтеза НА переход от гликозилированной по кору молек5щы к полной молекуле можно наблюдать при анализе методом SDS-гель-электрофореза белка, меченного S-метионином, или меченных тритием предшественников сахаров в экспериментах с пульсовой меткой. Конечный состав олигосахаридных боковых цепей на завершенных белках штамма дикого типа и А -бел-ках оказывается одинаковым. Однако в противоположность белку связывания мембраны дикого типа, который быстро и относительно синхронно гликозилирован, популяция секреторных молекул становится терминально-гликозилированной через очень длительный период. Возможно, это различие в некоторой степени отражает относительную эффективность, с которой белки связывания мембраны и относящиеся к просвету потока белки изолируются в транспортные везикулы, перемещаемые от грубого эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи. [c.183]

Гель-электрофорез. Электрофорез в полиакриламидном геле [на 7%-ном (масс./об.) геле] проводят, как описано в работе 24] гели окрашивают на белок по методике [24] или на GGT-активность с применением флуоресцентного метода, используя в качестве субстрата 7-( у-ь-глутамил)-4-метилкумарил-амид [25]. Готовят флуорогенный субстрат растворением 7-( - [c.152]

Весьма полезным методом изучения ДНК-белковых взаимодействий является так называемый футпринтинг (рис. 4.15). Некий белок, связанный с определенным участком ДНК, защищает его от расщепления, например, ДНКазой, которая в обычных условиях случайным образом вносит в ДНК одноцепочечные разрывы. На практике обычно вначале получают фрагменты ДНК, меченные по одному из концов одной цепи. Затем добавляют такое количество ДНКазы, чтобы внести в каждую молекулу в среднем не более одного разрыва, ДНК денатурируют и проводят гель-электрофорез. [c.102]

Гель-электрофорез используют не только для aHajiHTH4e KHX, но и для препаративных целей. Отмечено также, что связывание белка с фрагментом ДНК уменьшает его электрофоретическую подвижность, позволяя таким образом изучать особенности взаимодействия белок-ДНК. [c.465]

Разделение белковых фракции сыворотки крови с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Этим методом можно разделить сыиороточный белок на 18— 25 фракций, которые располагаются на столбике ге пя в следующей последователь юсти [c.39]

Эти белки характеризуют обычно посредством электрофореза в полиакриламидном геле, проводимого после диссоциации компонентов мембран с помощью додецилсульфата натрия (ДДС-N3). Когда в подходящих условиях происходит диссоциация, на электрофореграммах наблюдается несколько зеленых полос, соответствующих белково-хлорофилловым комплексам (рис. 6.8). Вполне вероятно, что в тилакоидах все хлорофиллы находятся в форме таких комплексов [73]. Некоторые комплексы включают хлорофилл а и хлорофилл б это собирательные антенны для фотонов или ССХБ (светособирающий хлорофилл — белок) [107]. На эти комплексы приходится до 50 % белков и хлорофиллов ла- [c.240]

Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций [1 ]. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этом увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом. [c.11]

Этот первый рецептор нейромедиатора, выделенный из центральной нервной системы, имеет следующие биохимические характеристики он является гликапротеином, состоящим из нескольких полипептидных цепей (по данным электрофореза в ДСН- полиакриламидН Ом геле М 48 000, 59 000 и 92 000) центр связывания стрихнина, по-видимому, локализован на самой короткой полипептидной цепи, и функции других цепей в настоящее время неизвестны рецепторный белок содержит единственный тип независимых связывающих участков для стрихнина. [c.295]

Подобно аффинной хроматографии, аффинный электрофорез в геле можно применять для определения констант диссоциации комплексов белок — лиганд. Принцип метода заключается в изучении зависимости подвижности данного белка от концентрации связанного лиганда в геле. Этот лиганд может быть либо ковалентно связан с гелем, либо только включен в гель (последнее обусловлено высокомолекулярными свойствами лиганда). Впервые такое использование электрофореза описано Такео и Накамурой [50], (хотя в этой работе еще не введен термин аффинный электрофорез ) константы диссоциации комплексов фосфорилаза— полисахарид определены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем различные концентрации ковалентно связанного полисахарида. Бег-Хансен [9] применил электрофорез на сефарозе с ковалентно связанным конканавалином А для определения констант диссоциации комплексов конканавалина А с сывороточными гликоиротеинами. [c.168]

Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты Е. oli имеет молекулярный вес 109 000 и состоит, вероятно, только из одной полипептидной цепи [59]. Это заключение основано на следующих фактах а) наблюдается отсутствие изменения молекулярного веса после разворачивания полипептидной цепи в растворе 6М гуанидингидрохлорида с 0,ЗМ -меркаптоэтанолом б) обнаружен только один N-концевой остаток метионина в) в присутствии денатурирующих агентов обнаружена только одна зона при электрофорезе в полиакриламидном геле. Насколько нам известно, еще не найден какой-либо другой фермент или белок, имеющий одну-единственную полипептидную цепь с молекулярным весом выше 100 000. Однако молекулы ферментов, состоящие из нескольких полипептидных цепей более высокого молекулярного веса, все же существуют (например, -галактозидаза Е. oli и миозин [60]). [c.396]

Наконец, в литературе описаны различные наследственные изменения в составе сыворотки крови. Нанример, наблюдалась наследственная аномалия альбумина, когда этот белок делился электрофоретически на две фракции. Но совершенно новая область для исследования наследственных изменений крови открылась, когда были разработаны методы иммуноэлектрофореза и электрофореза в гелях. Как уже говорилось, эти методы позволяют разделять сыворотку на десятки компонентов уже сейчас установлено большое количество генетически детерминированных модификаций трансферринов, гаптоглобинов и некоторых других белков в сыворотке крови человека. Так как изменения проявляются независимо друг от друга, наблюдаемая картина получается очень сложной и практически отличается у каждого отдельного человека. В этой области ведутся сейчас интенсивные исследования. [c.102]

Извлечение белков из геля связано с известными затруднениями. При замораживании и оттаивании геля образуется губчатая масса, из которой можно отсосать раствор, содержащий белок, но более высокий выход получают центрифугированием при умеренной скорости. При продолжительном хранении геля в замороженном состоянии происходит необратимая адсорбция некоторых белков. Гордон [20] описал остроумный метод, согласно которому белки из ломтиков геля удаляли путем вторичного электрофореза и улавливали их в небольшой объем раствора по одну сторону барьера из целлофановой пленки. Этот метод дает хорошие результаты в опытах с белками сыворотки, за исключением у-глобулпна. [c.257]

Смотреть страницы где упоминается термин Гель-электрофорез белков: [c.337] [c.189] [c.67] [c.467] [c.189] [c.195] [c.217] [c.270] [c.74] [c.76] [c.172] [c.73] [c.74] [c.76] [c.172] [c.536] [c.37] [c.64] [c.217] [c.73] [c.140] [c.144] [c.145] [c.31] [c.268] [c.141] [c.22] [c.37]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология