Аффинная хроматография

В обычной аффинной хроматографии для иммобилизации субстратов в качестве носителей используются агароза и сшитая сефароза. В качестве сшивающего агента обычно выступает ВгСМ, а мостик образован а,о)-диамином. Эти полисахаридные носители подвержены биодеградации, и, следовательно, органические полимерные гели более удобны в качестве матрицы и допускают более широкий набор химических модификаций. Именно эти причины побудили Уайт-сайдса и сотр. разработать новый метод иммобилизации ферментов в сшитых органических полимерных гелях [126]. По своей простоте и универсальности этот метод превосходит ранее предложенные. Особенно ценен он при иммобилизации относительно лабильных ферментов для использования в ферментерах большого размера при проведении реакций органического синтеза, катализируемых ферментами. [c.257]

Ферментативные системы, связанные с функцией кофермента В12, достаточно сложны. В связи с этим имеется несколько сообщений об очистке В12-зависимых ферментов или В12-связывающих белков с помощью аффинных сорбентов, обладающих сродством к витамину В12. Фактически для очистки ферментов или белков аффинная хроматография широко используется как один нз наиболее привлекательных методов [270]. С этой целью был разработан метод синтеза нерастворимого носителя кобаламинсефарозы (рис. 6.14). Этот носитель использован для очистки М-5-метилтетрагидрофолатгомоцистеин1юбаламинмстилтрапс-феразы из Е. oli. [c.394]

Ситуация заметно ухудшается в том случае, когда связывание белкового лиганда с матрицей происходит не в одной, а в нескольких точках. Об этом уже упоминалось при анализе условий фиксации лигандов на Br N-активированной сефарозе довольно много было сказано и в предыдуп(ей главе. Тем не менее имеет смысл остановиться на этом вопросе еще раз — в аспекте аффинной хроматографии. Многоточечное связывание белка с матрицей может приводить как к недоступности активного участка белковой молекулы, так и к ее денатурации за счет растяжения, т. е. к потере биологической активности. [c.386]

Инертный носитель может быть полиуретаном или полимером другого типа либо природным полимером (например, коллаген, легко выделяемый из шкур животных). Подвижный мостик присоединен к функциональной группе на полимерном геле. Длина мостика — важный параметр, так как свободный конец должен быть способен образовать ковалентную связь с функциональной группой фермента, не влияя на ферментативную активность. Такой фермент, пришитый к матрице, обычно называют иммобилизованным, ферментом [122—125]. В отличие от широко распространенного метода аффинной хроматографии в данном случае фермент, а не субстрат ковалентно сшпт с твердым носителем. Однако принцип биоспецифического узнавания тот же. [c.257]

Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице. [c.11]

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугирования и декантации. Эти методы рассмотрены ниже наряду с аффинной хроматографией на колонках. [c.11]

Нафталиновое кольцо выступает в роли прокладки между поверхностью твердофазного носителя и акцептором. Таким образом удалось ковалентно закрепить оптически чистый акцептор на силикагеле и полученный твердофазный носитель использовать для разделения солей первичных аминов и аминоэфиров с помощью жидкостной хроматографии. Такой метод можно назвать аффинной хроматографией, специфичной к энантио-мерам. [c.272]

Использование остатка фенилборной кислоты в качестве лиганда для аффинной хроматографии молекул, содержащих свободную цис-диольную группу рибозы, в последнее время приобретает все большую популярность. Два гидроксила фенилборной кислоты охотно взаимодействуют с г/мс-диольной группой, образуя комплекс по следующей схеме [c.373]

К матрице аффинного сорбента, помимо общих для всех хроматографических матриц требований (нерастворимость п гидрофильпость, жесткость, подходящая форма и размер гранул, химическая стабильность в условиях модификации и в самом хроматографическом процессе, отсутствие неспецифической адсорбцип ж др.), предъявляется требование наличия химических групп, позволяющих с помощью несложной химической реакции ковалеитио связывать с матрицей разнообразные биологические молекулы (лиганды и спейсе-ры). Наиболее удобными с этой точки зрения оказались гидроксильные группы полисахаридных матриц — агарозы и сефадексов, а также амидные группировки полиакриламидного геля. Если иметь в виду аффинную хроматографию белков или использование белко- [c.342]

В рассмотренных реакциях фигурировали уже активированные матрицы. Теперь познакомимся со способами их получения, т. е. с реакциями активации сначала полисахаридных. матриц, а затем п акриламида. Хотя в продаже имеется целый ряд уже активированных матриц (которые мы назовем ниже), получение их в лабораторных условиях иногда оказывается оправданным свободой выбора степени активации, что, как мы увидим, может играть немалую роль в оптимизации условий аффинной хроматографии. [c.347]

Кислый аминополисахарид гепарин [М> 10 ООО) известен в качестве антикоагулянта крови. Кроме того, он применяется в биохимии как ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому-отражает некоторое сходство полимера, содержащего две-три суль, фогруппы на каждую дисахаридную структурную единицу, с РНК-Две эти особенности определили использование гепарина в качеств, лиганда для аффинной хроматографии факторов коагуляции крове и (особенно широко) для очистки белков, взаимодействующих и нуклеиновыми кислотами (полимераз, обратной транскриптазы, рес стриктаз, факторов инициации и элонгации белкового синтеза и др.). Кроме того, иммобилизованный гепарин связывает липопротеид-липазы и некоторые липопротеиды. Гепарин-агароза выпускается всеми упомянутыми фирмами-поставщиками аффинных сорбентов, кроме Bio-Rad . [c.370]

В дальнейшем шиффовы основания могут быть восстановлены. Возможность внутреннего вращения в звеньях сшивки обеспечивает доступность реакционно-активной части фермента по отношению к субстрату, на который данный фермент воздействует в высокоизбирательных реакциях биокатализа или в упомянутой в разделе 5.1 биоспецифической (аффинной) хроматографии ферментов. [c.109]

Специфичность методов аффинной хроматографии наряду с избирательной сорбцией кетоаминной фракции НЬ Ale на ПААГ определяется спектрофотометрической детекцией гема, имеющего максимальную величину оптической плотности при длине волны 415 нм. Это обстоятельство позволяет избежать искажения результатов анализа за счет присутствия других гликолизированных белков эритроцитов или плазмы крови. [c.67]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

Рис. 6.14. Получение нерастворимого носителя кобаламинсефарозы для очистки Ви-зависимых ферментов с помощью аффинной хроматографии [270].

Свойства агарозы были рассмотрены в первой книге >той серии, посвященной электрофорезу [Остерман, 19811. Однако ввпду центральной роли, которую играют агарозные матрицы в иекотор .г хроматографических методах (гель-фнльтрация, аффинная хроматография), имеет смысл привести здесь некоторые данные еще раз. Как и [c.53]

См. книгу Туркова Я. Аффинная хроматография. Пер. с англ.— М. Мир, 9 Зак. 649 [c.257]

Ж. X. примен. для разделения и анализа р-ров в-в, имеющих небольшое давление насыщ. пара или неустойчивых при повышенных т-рах, а также для физ.-хим. исследований, напр, для определения констант Генри при адсорбции из р-ров. Миним. погрешность измерений составляет ок. 1%. Для разделения ионов металлов и неметаллов успешно использ. т. н. экстракц. хроматография, в к-рой неподвижной фазой служит орг. р-ритель (экстрагент), а недвижной — водные р-ры исследуемых соединений. К колоночной Ж. X. относятся также эксклюзионная хроматография, аффинная хроматография и ионообменная хроматография. Ж. X. предложил М. С. Цвет в 1903—06. [c.204]

Отметим, что анионообменники с ионогеннымн группами двух последних типов разработаны для специальных целей. Так, радикалы PEI предназначены для связывания полианионов регулярного цепочечного строения, например олигонуклеотидов, а РАБ — для ковалентного присоединения белков и НК с помощью реакции диазотирования (для аффинной хроматографии). [c.252]

Туркова Я. Аффинная хроматография. — М. Мир, 1980, [c.349]

Нелгаловаж пым преимуществом аффинной хроматографии является II то обстоятельство, что в ией гидролитические ферменты (про-теазы, нуклеазы п др.) с самого начаДа отделяются от своих субстратов. В частности, этим обстоятельством обусловлен высокий выход очищаемых макромолекулярных препаратов, характерный для аффинной хроматографии. [c.341]

В нашей области интересов целлюлозные матрицы в чистом виде используются для нормальнофазовой распределительной хроматографии (главным образоы, при ТСХ), а модифицированные — в ионообменной и аффинной хроматографии. [c.51]

Поэтому мы начнем изложение с краткой характеристикп используемых в настоящее время компонентов аффинных сорбентов матриц, лигандов и спейсеров. Одновременно рассмотрим способы соединения их между собой, ограничившись только теми немногими пз большого числа вариантов, испробованных и описанных в прошлом десятилетии, которые выдержали проверку временем. Впрочем, к ним имеет смысл добавить два-три только что предложенных способа, обещающих какие-то новые преимущества. Затем можно будет проанализировать более подробно параметры и характерные особенности процесса аффинной хроматографии и на основании этого анализа сформулировать некоторые рекомендации по практической постановке эксперимента. [c.342]

Реакция конденсации идет при комнатной температуре с перемешиванием суспензии в течение ночи. По окончании ее сорбент обильно промывают 50%-ным этанолом, 3—4 объемами 1 М Na l и, наконец, деионизованной водой. Блокировать оставшиеся свободными спейсеры нет нужды впрочем, это можно сделать так же, как прп пспользованпи карбодиимида. Хранят сорбент уравновешенным буфером для аффинной хроматографии на холоду, с добавкой бактериостатического агента. [c.384]

Отметим так ке, что аффинную хроматографию ввиду избирательности сорбцшг и очень высокого значення коэффициента распределения сорбируемого вещества (в пользу матрицы) отличает возможность использовать большие объемы исходных препаратов и в ходе ступенчатой элюцпи осуществлять их весьма эффективное концентрирование. [c.341]

Есть еще одна особенность аффинной хроматографии, которую следует отметить с самого начала. Способ связывания биологически активного лиганда с матрицей обязан не только обеспечивать сохранение его активности, по п не создавать стерических препятствий для взаимодействия сорбируемого вещества с лигандом. Когда в качестве лиганда выступает биополимер (белковый антиген или субстрат, нуклеиновая кислота) и его участок биоспецифического взаимодействия оказывается достаточно удаленным от точки закреплетшя па матрице, то эта проблема не возникает. [c.341]

Содержание спейсерных групп в обеих матрицах составляет 15 мкмоль на 1 мл влажного геля. Эта же фирма выпускает и два геля для аффинной хроматографии на чпсто полиакриламидной основе с одинаковыми короткими спейсерами следующего вида —СО—NH—(СН2)2—NHj. Их торговые названия — Aminoethyl Bio-Gel Р2 и Aminoethyl Bio-Gel Р150 . Очевидно, эти гели отличаются друг от друга по своей пористости. [c.359]

Из числа известных лектинов в аффинной хроматографии чаще других используется конканавалин А ( Сои А ), получаемый из бобов [c.363]

Фирма IBF рекомендует следующие стандартные условия для такой посадки. Активированный гель уравновешивают 0,5 М фосфатным буфером (pH 7,6) и вносят в раствор белка в том же буфере из расчета 5—10 мг белка на 1 мл геля. Можно использовать и другие-буферы, не содержащие первичных аминов, с pH в интервале 6,9— 8,5. Инкубацию проводят с перемешиванием при 4 в течение 18 ч. Если биологическая устойчивость лиганда это допускает, инкубацию можно вести и при комнатной температуре, сократив ее продолжительность. Излишек лиганда отмывают на фильтре 8—10 объеигами того же буфера. Затем осуществляют блокировку незанятых активных групп 0,1 М раствором забуференного (pH 7,5—8,5) этаноламина в течение 3 ч при 4° можно пспользовать также растворы Триса, глицина, /) у-лизина и др. Гель снова промывают 8—10 объемами того же буфера с добавлением до 0,15 М Na l, потом уравновешивают буфером для аффинной хроматографии и хранят в суспензии на холоду с добавкой 0,02% мертиолата или азида натрия. [c.381]

Химический энциклопедический словарь (1983) -- [ c.60 ]

Аминокислоты Пептиды Белки (1985) -- [ c.353 , c.354 ]

Биологическая химия (2002) -- [ c.246 ]

Высокомолекулярные соединения (1981) -- [ c.554 ]

Большой энциклопедический словарь Химия изд.2 (1998) -- [ c.60 ]

Хроматографические материалы (1978) -- [ c.119 , c.124 ]

Хроматография Практическое приложение метода Часть 2 (1986) -- [ c.0 ]

Ферменты Т.3 (1982) -- [ c.65 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.213 ]

Методы общей бактериологии Т.3 (1984) -- [ c.216 , c.221 ]

Высокомолекулярные соединения Издание 3 (1981) -- [ c.554 ]

Практическая химия белка (1989) -- [ c.152 , c.180 , c.195 , c.226 ]

Антитела Методы Т.1 (1991) -- [ c.0 ]

Иммунология Методы исследований (1983) -- [ c.60 , c.64 , c.68 ]

Методы исследований в иммунологии (1981) -- [ c.19 , c.58 , c.73 , c.152 , c.152 , c.153 , c.153 , c.190 ]

Введение в мембранную технологию (1999) -- [ c.19 ]

Биосенсоры основы и приложения (1991) -- [ c.467 , c.507 ]

Основы биохимии (1999) -- [ c.97 , c.190 , c.221 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.213 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология