Целлюлоза для аффинной хроматографии

В случае хранения в замороженном состоянии при —20 °С рекомендуется разделять антисыворотку на партии небольших объемов, чтобы не подвергать ее многократному замораживанию и размораживанию. При использовании некоторых методов необходимо, чтобы иммуноглобулины IgG были отделены от других сывороточных белков. Осаждение сульфатом аммония или комбинирование этой операции с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [31, 36] или с аффинной хроматографией при использовании белка А, иммобилизованного на носителе [48], позволяет легко, но более или менее тщательно очистить эти иммуноглобулины. Иммуноаффинная хроматография, используя очищенный иммобилизованный антиген, дает возможность производить очистку специфических антител белка при разделении фракции IgG или даже антисыворотки. [c.97]

Целлобиазы ( -глюкозидазы), как правило, имеют существенно более высокую молекулярную массу (120-180 кЛа), которая может в несколько раз возрастать за счет склонности фермента к ассоциации с образованием комплексов. Изоэлектрические точки многих целлобиаз лежат в близкой к нейтральной области, хотя большинство ферментов имеют р1 4,5-5,5. По адсорбционной способности целлобиазы значительно уступают другим компонентам целлюлазного комплекса, что позволяет выделять их методами аффинной хроматографии на целлюлозе. Биохимические характеристики ферментов из ряда микробных источников приведены в табл. 5.1. [c.121]

Хотя целлюлоза применялась как носитель преимущественно в начальный период развития аффинной хроматографии, она все еще используется и в настоящее время (табл. 11.1). [c.180]

АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА ПРОИЗВОДНЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ [c.39]

Как было показано выше, целлюлоза была первым носителем в аффинной хроматографии. Обзор данных по применению целлюлозы для выделения антител и антигенов приведен в работе [81]. Данные о ковалентном связывании нуклеотидов, полинуклеотидов и нуклеиновых кислот обобщены в статье [33]. Хотя в настоящее время в аффинной хроматографии применяются и другие твердые носители, целлюлоза не потеряла своего значения. Трипсин, связанный с целлюлозой, по-прежнему ис- [c.40]

Целлюлоза отличается высокой степенью гидрофильности, а наличие большого числа гидроксильных групп дает возможность ее легко модифицировать путем введения различных заместителей. Препараты целлюлозы для придания им химической устойчивости сшивают эпихлоргидрином. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются ее аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированная целлюлоза благодаря простоте получения, сравнительно низкой стоимости относится к удобным носителям для иммобилизации ферментов и аффинной хроматографии. [c.10]

В литературе описано большое число производных целлюлозы, которые постоянно использовались при разработке методологии очистки белков. При этом, однако, всегда отмечалось наличие ряда ограничений в применении целлюлозы не толька в обычных методах очистки, таких, как ионообменная хроматография, но и в аффинной хроматографии. Эти ограничения связаны в основном с неблагоприятной физической структурой (недостаточной пористостью) и неподходящей геометрической формой отдельных частиц. Кроме того, дополнительные затруднения для такого использования целлюлозы обусловлены наличием обширных микрокристаллических участков внутри матрицы. Недавно большинство указанных недостатков, относящихся к применявшейся ранее фибриллярной, порошкообразной целлюлозе, были устранены были разработаны новые виды целлюлозных носителей, например пористая сферическая цел люлоза. [c.19]

Сферическая целлюлоза была предложена как удобная матрица для аффинной хроматографии ввиду правильной сферической формы ее частиц, высокой пористости и хорошей механической прочности, а также ярко выраженной гидрофильности. В одном сообщении [19] указывается на возможность хроматографии на иммобилизованном красителе, однако в работе [20] эти данные не подтвердились. В то же время ряд ферментов был успешно иммобилизован на сферической целлюлозе. [c.22]

Очевидно, что такой сорбент частично сохраняет анионные свойства за счет остаточных свободных аминогрупп АЕ-целлюлозы, поэтому аффинную хроматографию следует вести в присутствии достаточной концентрации соли, блокирующей неспецифическую ионную сорбцию по этим группам [Feist, Danna, 1981]. Использование этого сорбента для разделения меркурированной и немеркурированной РНК рассмотрено ниже как пример применения аффинной хроматографии. [c.397]

Случае была saMetHo прочнее, 4to позволило промывать колонку с сорбированным па пей препаратом 0,15 М раствором КСЛ в буфере, а элюцию вести линейным градиентом 0,15—0,9 М КС1. ДНК-по-лимеразная активность выходила широким пиком в ее последующей очистке использовалось еще три варианта аффинной хроматографии на генарин-сефарозе, ДНК-целлюлозе п олиго((1Т)-целлюлозе. [c.422]

В приведенных ниже примерах аффинную хроматографию на ДНК, иммобилизованной на целлюлозе путем высушивания или с дополнительной пришивкой УФ-облучением, использовали для очистки ДНК-узнающих белков. При этом не предпринималось Гникаких усилий по отбору для иммобилизации каких-либо определенных участков ДНК белки сами находили в гетерогенной популяции молекул ДНК участки своего биоспецифического связывания. [c.424]

Аффинную хроматографию на ДНК-целлюлозе использовали па первом этапе очистки белка-продукта гена 32 фага Т4. Зараженные фагом клетки Е. oli вскрывали ультразвуком, бактериальную ДНК [c.424]

Пример 14. Очистка полн(А)-РНК на олиго((1Т)-целлюлозе [Bantle et al., 1976]. Метод очпстки полп(А)-РНК из суммарной РНК полисом аффинной хроматографией на олиго(с1Т)-целлюлозе пользуется чрезвычайно широкой популярностью благодаря своей простоте и эффективности. Существенным преимуществом этого сорбента по сравнению с полп(и)-сефарозой является его неуязвимость для рибонуклеаз, присутствующих, как правило, в очищаемых препаратах РНК. [c.445]

Хроматография на КМ-целлюлозе. Аффинная элюция. Измеряют pH раствора и доводят его соляной кислотой до 7,2. Раствор белка наносят на колонку с КМ-целлюлозой (13X5,5 см), уравновешенную буфером А, pH 7,2. После того как белок адсорбировался на колонке, ее промывают 75—100 мл буфера А (скорость тока 200 мл/ч). На этой стадии может потребоваться использование перистальтического насоса. Затем колонку промывают буфером Б, pH 8,0. При этом элюируются различные примесные белки, а лактатдегидрогеназа остается связанной с носителем. После того как через колонку пройдет 5—6 объемов буфера Б, оптическая плотность элюата при 280 нм начинает уменьшаться. Необходимо продолжать промывание буфером Б до тех пор, пока снижение Л280 не прекратится ( 280 может достигнуть значения 0,1—0,2 или меньше). Затем на колонку подают буфер В. После прохождения через колонку 1—2 объемов этого буфера определяют активность лактатдегидрогеназы в собираемых фракциях. В случае ее отсутствия на колонку подают буфер Г. Определяют активность лактатдегидрогеназы во фракциях элюата. Если ее нет либо она незначительна, на колонку подают буфер Д. Собирают фракции, определяют в них активность фермента и содержание белка (по поглощению при 280 нм за вычетом фона, который дает НАДН). Фракции, содержащие наибольшую активность, объединяют и добавляют к ним ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ и мелкоизмельченный сульфат аммония для кристаллизации. [c.276]

Фракционное осаждение сульфатом аммония, аффинная хроматография на порошковой целлюлозе, хроматография на ДЕАЕ-сефадексе, сефакриле 3-200 [c.124]

Создан противоточный реактор непрерывного действия для ферментативного гидролиза [1] В этом реакторе реализован ряд новых принципов Во-первых, рабочая зона колонного реактора плотно наполняется целлюлозой, чем достигается ее более высокая концентрация (до 40%) и более высокая объемная скорость гидролиза, чем в реакторах другого типа, например с перемешиванием Во-вторых, целлюлазы удерживаются на целлюлозе в реакторе за счет адсорбции по принципу аффинной хроматографии Это позволяет обойтись без специальных мембран, удерживающих ферменты в реакторе, что удешевляет процесс В-третьих, в таком реакторе можно использовать культуральные жидкости с достаточно низким содержанием целлюлазы, так как эти ферменты концентрируются в реакторе за счет адсорбции В-четвертых, протеазы и другие ферменты, инактивирующие целлюлазы, удаляются из реактора еще до начала гидролиза целлюлозы, поскольку они, как правило, адсорбируются на целлюлозе [c.211]

Ионообменная хроматография на целлюлозе на полидекстранах на смолах Аффинная хроматография Прочие методы [c.10]

В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. Если иммобилизовать один из компонентов комплекса, то получится специфический сорбент для второго его компонента, при этом, разумеется, предполагается, что соблюдаются все условия, необ.ходимые для образования этого комплекса. Связывающие участки иммобилизованных веществ должны сохранять хорошую стерическую доступность для второго участника комплекса даже после связывания с нерастворимым носителем и не должны деформироваться. Примерами первых специфических сорбентов, приготовленных путем ковалентного связывания с нерастворимым носителем, были иммобилизованные антигены (Кемпбелл и др. [5]) . Методы, созданные для присоединения антигенов и антител к нерастворимым носителям, были сразу же применены для получения иммобилизованных ферментов. В то же время ранее предложенный азидный способ привязки ферментов к целлюлозе [25] стал использоваться для приготовления иммуносорбентов. Параллельное развитие обоих направлений, основанных на использовании связывания биологически активных веществ с нерастворимыми носителями, наглядно демонстрируют названия первых обзорных статей Реакционноспособные полимеры и их использование для приготовления смол с антителами и ферментами (Манеке [23]), Водонерастворимые производные ферментов, антигенов и антител (Сильман и Качальский [39]) и Химия и использование производных целлюлозы для изучения биологических систем (Великий и Витол [47]). Оба направления продолжали развиваться параллельно и после открытия других более эффективных носителей и разработки методов связывания, позволяющих сохранять свойства иммобилизуемых веществ в растворе. [c.11]

Аффинная хроматография как метод, по-видимому, впервые была применена Штаркенштайном в 1910 г. [21] для выделения а-амплазы с помощью нерастворимого субстрата (крахмала). Принцип аффинной хроматографии, использующий аффинанты, ковалентно связанные с нерастворимой матрицей, известен более 20 лет. Кемпбелл и др. [6] были, вероятно, первыми (1951 г.), в чьих работах этот принцип получил практическое приложение для выделения антител на колонке с целлюлозой с ковалентно присоединенным антигеном. Для выделения ферментов аффинная хроматография впервые была применена в 1953 г. Лерманом [15], который выделил тирозиназу на колонке с целлюлозой, эфирно связанной с остатками резорцина. В последующие годы аффинная хроматография использовалась весьма редко, что, очевидно, об- [c.15]

Развитие аффинной хроматографии сопровождается увеличением количества продажных иммобилизованных аффинных лигандов. Для составления общей картины о применении некоторых веществ в практике аффинной хроматографии в табл. 11.1 перечислены промыптленные названия носителей и иммобилизованных аффинных лигандов. Из цитированной в таблице литературы очевидно, что в настоящее время очень возросло применение продажных п.ммобилизованных аффинных лигандов, например конканавалина А, связанного с сефарозой ( кон А — сефароза). Можно полагать, что то же ожидает и другие хроматографические материалы. Точно так же как сегодня в очень редких лабораториях готовят ДЭАЭ- и КМ-целлюлозу, совершенно закономерно, что будет постепенно увеличиваться использование продажных био-специфических сорбентов. Это справедливо прежде всего для сорбентов с групповой специфичностью или сорбентов специфических к веществам, постоянно получаемым в лабораториях, и обусловлено специфической природой аффинной хроматографии. Из разнообразия биологически активных веществ следует, что необходим очень широкий ассортимент специфических сорбентов поэтому много научных работников, по-видимому, будут вынуждены сами готовить специальные высокоэффективные сорбенты. [c.137]

Обзор связанных аффинных лигандов, иреимущественно белковой природы, на целлюлозе п ее производных сделан Сильма-ном и Качальским [67], обзор связывания ферментов — Круком и сотр. [11], а связывания нуклеотидов, полинуклеотидов и нуклеиновых кислот — Гиламом [22]. В этих обзорах упомянуто много различных методов связывания. Поскольку в настоящее время целлюлоза находит ограниченное использование в аффинной хроматографии, здесь кратко отмечаются только некоторые из методов связывания. [c.178]

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Выявленные закономерности адсорбции целлюлаз на целлюлозе и поведения адсорбированных ферментов позволили сформулировать требования к конструкции реактора для ферментативного гидролиза целлюлозы и проверить их на практике. В результате были выработаны принципы создания противоточных ферментных реакторов для непрерывного гидролиза целлюлозы. Особенности действия подобных реакторов следующие. 1. Рабочая зона колонного реактора плотно набивается целлюлозой, этим достигаются ее более высокие концентрации (до 40—60%) и объемная скорость гидролиза, а отсюда и больший выход продукта реакции — глюкозы, чем в реакторах другого типа, например с перемешиванием. 2. Целлюлазы удерживаются на целлюлозе в реакторе за счет адсорбции по принципу аффинной хроматографии. Это позволяет обойтись без специальных мем- [c.41]

В аффинной хроматографии и твердофазном секвенсировании часто бывает необходимо определить количество белка, связанного с инертной матрицей, такой, как агароза, декстраны и целлюлоза. В принципе это может быть сделано гидролизом образца с последующим определением общего азота, но в матрицу может быть включен небелковый азот, например когда исполь- [c.313]

Следует подчеркнуть, что большинство препаратов иммуноглобулина определенного класса обычно содержит примеси Ig других классов, за исключением IgG, выделенных хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, и IgM, выходящих в первом пике при хроматографии на сефадексе G-200. Поэтому рекомендуется проводить рехроматографию полученных препаратов на той же колонке и в тех же условиях, либо использовать какую-то иную процедуру, например электрофорез в агарозном блоке или гель-фильтрацию. Для той же цели можно применить и аффинную хроматографию на сефарозе с класс-специфической антисывороткой. Миеломные белки классов G, А и М и парапротеины при макроглобулинемии Вальденстрёма удается очистить одноэтапной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе или зональным электрофорезом, поскольку они являются основным компонентом сыворотки. Чистоту каждой фракции иммуноглобулинов исследуют с помощью иммуноэлектрофореза, двойной иммунодиффузии или радиоиммунным методом с класс- или подкласс-специфическими антисывороткамн. Чистые белки хранят при 4°С в присутствии 0,02% NaNs или замораживают растворы с концентрацией 10— 30 мг/мл. [c.72]

Смотреть страницы где упоминается термин Целлюлоза для аффинной хроматографии: [c.304] [c.343] [c.424] [c.432] [c.443] [c.122] [c.123] [c.126] [c.154] [c.60] [c.143] [c.174] [c.7] [c.20] [c.14] [c.30] [c.20] [c.42] [c.131] [c.379] [c.30] [c.213]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология