Нерастворимые носители для аффинной хроматографии

В настоящее время наиболее распространенными методами иммобилизации ферментов являются методы ковалентного присоединения к нерастворимым носителям. Требования, предъявляемые к свойствам нерастворимых носителей, перечень этих носителей и ряд методов для присоединения белков детально обсуждаются в гл. 8. Некоторые методы, пригодные для характеристики иммобилизованных ферментов, содержатся в гл. 9. Несмотря на то что стеклянные носители редко применяются в аффинной хроматографии, они наиболее часто используются для иммобилизации ферментов для этих целей также весьма полезными, по-видимому, могут оказаться некоторые керамические носители. Очень много данных, подкрепленных многочисленными примерами иммобилизованных ферментов, их свойств и применения, имеется в ряде обзоров и монографий [2, 15, 37, 39, 44, 57, 58]. [c.422]

Адсорбенты для аффинной хроматографии обычно состоят из трех ковалентно-связанных компонентов, нерастворимого носителя, ножки (спейсера) и специфического лиганда. [c.444]

Идея методов разделения белков, основанная на сродстве молекул, которое обнаружено в биологических системах, известна несколько десятилетий (с тех пор, как стали привязывать ферменты к нерастворимым носителям). Нерастворимые гетерогенные катализаторы имеют определенные преимущества легкость выделения из реакционной смеси, возможность осуществления непрерывного катализа и повышение стабильности ферментов. Тем не менее по ряду причин полного развития аффинная хроматография и связывание ферментов с нерастворимыми носителями достигли лишь в последние годы. Развитие обоих направлений началось с использования высокопористых гидрофильных носителей, главным образом агарозы, после разработки подходящих методов связывания (Аксен и др. [1], Порат и др. [32]). [c.10]

Аффинной хроматографии и связыванию ферментов с нерастворимыми носителями посвящено много обзорных статей [4, 6—9, 11 — 17, 26, 30, 31, 34, 35, 41, 42, 46]. [c.12]

Основной предпосылкой для проведения аффинной хроматографии является образование специфического комплекса ЕЬ между выделяемым ферментом Е и аффинным лигандом Ь, связанным с нерастворимым носителем. Применимы следующие уравнения [c.20]

Наиболее важным неорганическим нерастворимым носителем без сомнения является стекло, которое очень часто используется для приготовления иммобилизованных ферментов и реже сорбентов для аффинной хроматографии. В табл. 8.7 перечислены марки некоторых хроматографических пористых стекол и фирмы, производящие их. [c.208]

Условия проведения аффинной хроматографии зависят от природы соединения, которое нужно выделить. Однако существует ряд общих требований, касающихся свойств нерастворимого носителя, выбора типа аффинного лиганда, его связывания с носителем, условий адсорбции и элюирования. [c.7]

Для успешного проведения аффинной хроматографии необходимо не только связывание аффинного лиганда, но и полное удаление всего аффинного лиганда, нековалентно связанного с носителем. Поэтому соединения следует тщательно промывать, контролируя результаты промывки. Сорбированные ароматические соединения можно успешно удалить с помощью органических растворителей, а для удаления белков полезна промывка денатурирующими агентами, если они не влияют на носитель и на связывающую способность аффинного лиганда. Необходимо быть уверенным в том, что измеряемая биологическая активность специфического адсорбента действительно обусловлена только ковалентно связанным аффинным лигандом. С этой целью определяют изменение концентрации нерастворимого производного после инкубирования в различных буферных растворах или после других подходящих обработок сорбента. [c.12]

НЕРАСТВОРИМЫЕ НОСИТЕЛИ ДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ [c.13]

Количество исследований, в которых в качестве нерастворимого носителя применяется агароза и ее производные с привитыми аффинными лигандами, увеличивается по мере развития аффинной хроматографии, и полный обзор таких работ в рамках одной главы практически невозможен. Так, в 1968 г. были опубликованы всего две работы, описывающие использование агарозы в качестве носителя в аффинной хроматографии, в 1969 г. таких работ было уже примерно 10, а в 1970 г. — около 20, а в 1971 г. — более 40, в 1972 г. — более 70, а в последующие годы это число было вновь превышено. В табл. 7.3 приведены некоторые примеры использования агарозы в аффинной хроматографии, показывающие возможности этого метода. [c.38]

В последние десять лет метод аффинной хроматографии [23— 27] играет важную роль при выделении биологически активных белков. В этом методе колонки заполняют нерастворимым носителем, с которым ковалентно связаны лиганды, обладающие сродством к выделяемому белку (так называемые аффинные лиганды). Когда раствор смеси различных веществ проходит через такую колонку, на ней сорбируется лишь интересующий исследователя белок, а все остальные соединения вымываются. Сорбированный на колонке белок выделяют, либо нарушая взаимодействие макромолекулы с иммобилизованным лигандом, либо воздействуя на него конкурирующим лигандом, присутствующим в элюирующем буфере. Такого рода специфические взаимодействия возникают между ферментами и их ингибитора- [c.109]

Рис. 6.14. Получение нерастворимого носителя кобаламинсефарозы для очистки Ви-зависимых ферментов с помощью аффинной хроматографии [270].

И спользованне аффинной хроматографии тем не менее не ограничивается только выделением биологически активных веществ. Уже в 1960 г. Яги и др. [22] описали определение небольших количеств антител с помощью нерастворимых носителей с привязанными антигенами. Применение нерастворимых носителей в количественном радиоиммунном анализе детально рассмотрено в ра.зд. 11.7. Иммобилизованные олигомеры полнтпмидиловой кислоты использовали Эдмондс и др. [11] для количественного определения полнадениловой кислоты. Аффинная гель-фильтрация как микрометод при экспрессных определениях молекулярных масс [c.16]

В последние годы все более широкое применение в химии углеводов находит важный и относительно новый метод, известный под названием аффинной хроматографии. Этот метод включает использование носителей с лигандами, имеющими значительное сродство к молекулам с определенной стереохимией. Лиганд, который в данном случае представляет собой лектин (гемагглютинирующий гликопротеин), ковалентно присоединяется к нерастворимой матрице, обычно агарозной или полиакриламидной природы. При хроматографии полисахариды или гликопротеины, содержащие группировки, связывающиеся с лектином, удерживаются на подобного рода носителях и таким образом отделяются от других компонентов, которые быстро проходят через колонку. Связанные с носителем соединения далее можно десорбировать путем элюирования колонки раствором низкомолекулярного углевода, содержащего группировку, специфически связывающуюся с лектином. Тот же эффект достигается при изменении pH или ионной силы элюента с тем, чтобы разрушить образовавшийся ранее комплекс адсорбированного соединения с иммобилизованным лектином. [c.34]

При использовании аффинной хроматографии для выделения антигена из раствора используют антитела, иммобилизованные на нерастворимом носителе. При этом ключевым параметром иммуносорбции становится аффинность моновалентного взаимодействия [17]. Благодаря высокой концентрации МКА, присоединенных к гелю, связывание антигена, как правило, происходит достаточно быстро, и лишь в исключительных случаях кинетические параметры иммуносорбции требуют скорости потока меньшей, чем обычно используемая — один объем колонки в час. Выявление МКА обычно основано на поливалентном связывании с антигеном (см. рнс. 5.1), в котором участвуют как низко-, так и высокоаффинные антитела. Однако для аффинной хроматографии требуются антитела, обеспечивающие моновалентное связывание. Поэтому среди имеющихся МКА необходимо провести дополнительный отбор препаратов, обладающих нужной аффинностью. Это можно сделать, например, по способности МКА вызывать иммунопреципитацию антигена или по торможению растворимым (одновалентным) антигеном связывания с поливалентным антигеном, иммобилизованным на поверхности клеток или пластиковых панелей [17]. На рис. 5.2 схематично изображены взаимодействия, возможные при реакции торможения. Очевидно, торможение происходит лишь в том случае, если время диссоциации 50% моновалентных связей примерно равно или превышает время проведения самого анализа. Антитела, у которых 1./, составляет более 10 мин. [c.171]

Аффинная хроматография используется для выделения таких белков, как ферменты, иммуноглобулины, лектины, рецепторные белки, которые обладают способностью специфически связываться с другими веществами. Несмотря на то что этот метод разработан сравнительно недавно, он уже оказал мощное влияние на развитие методологии очистки белков. Принцип метода состоит в следующем лиганд Ь, который обладает способностью специфически связываться с выделяемым белком, прочно закрепляют иа нерастворимом носителе М. Полученный таким образом адсорбент МЬ суспендируют в подходящем растворителе и переносят в хроматографическую колонку. Затем через колонку пропускают смесь, содержащую выделяемый белок. Белок Р связывается со специфическим адсорбентом благодаря нековалентным взаимодействиям [c.158]

Ферментативные системы, связанные с функцией кофермента В12, достаточно сложны. В связи с этим имеется несколько сообщений об очистке В12-зависимых ферментов или В12-связывающих белков с помощью аффинных сорбентов, обладающих сродством к витамину В12. Фактически для очистки ферментов или белков аффинная хроматография широко используется как один нз наиболее привлекательных методов [270]. С этой целью был разработан метод синтеза нерастворимого носителя кобаламинсефарозы (рис. 6.14). Этот носитель использован для очистки М-5-метилтетрагидрофолатгомоцистеин1юбаламинмстилтрапс-феразы из Е. oli. [c.394]

Таким образом, в аффинной хроматографии используется нерастворимый носитель, на котором иммобилизуется соединение, называемое лигандом он особым образом связывает подлежащий очистке продукт, находящийся в подвижной, обычно жидкой фазе. Лиганд иммобилизуют на носителе чаще всего посредством ковалентных связей, но иногда пользуются другими возможностями, такими, как ионный обмен, адсорбция, микроинкапсулирование и пр. Аффинная хроматография — это своего рода адсорбционная хроматография, при которой связывание происходит в соответствии со специфическими свойствами двух молекул. Эти свойства обусловливают взаимодействия различного характера — ионные, водородные, гидрофобные и др. в зависимости от конформации и размера молекул (рис. 3.3). [c.80]

В качестве аффинных лигандов можно использовать любые соединения, прочно, специфично и обратимо связывающиеся с выделяемым веществом. Химическое строение аффинных лигандов может быть самым различным. Поскольку в настоящее время метод аффинной хроматографии применяется главным образом для выделения ферментов и их ингибиторов [89J, мы рассмотрим примеры, взятые из этой области. Как уже упоминалось, при выделении фермента аффинными лигандам1И могут служить его ингибитор, аналогичный субстрату, а также эффектор, кофактор и в отдельных случаях даже субстрат. Это справедливо и для фермента, требующего длл реакции два субстрата, но способного достаточно сильно связываться только с одним из них. Субстрат также можно использовать для адсорбции фермента в таких условиях, когда фермент связывается, но сам не способен катализировать реакцию (например, в отсутствие ионов металлов, необходимых для реакции), а также когда константа Михаэлиса зависит от pH или температуры. Аффинный адсорбент для выделения белков обычно трудно получить из аффинного лиганда, если константа диссоциации его комплекса с белком превышает (0,5—1,0)-Ю [16]. Однако Стире и сотр. [84] показали, что очень эффективный адсорбент для р-галактозидазы можно получить даже из такого относительно слабого ингибитора, как н-аминофенил-р-о-тиогалактопирано-зид (/i , 5-10 ). Этого удается достигнуть, повышая концентрацию нерастворимого аффинного лиганда и увеличивая расстояние между аффинным лигандом и матрицей носителя, что приводит к максимальной доступности аффинного лиганда, для белка в растворе. [c.9]

Хроматографические методы, в которых разделение компонентов смеси основано на различии в размерах, форме или суммарном заряде молекул, часто недостаточно эффективны для разделения смесей белков. В таких случаях может оказаться полезной аффинная хроматография [48]. Успех метода зависит от того, удастся ли найти вещество, которое будет специфически взаимодействовать с подлежащим очистке белком. Для фермента таким веществом может быть конкурентный ингибитор катализируемой этим ферментом реакции, а для участвующего в гормональной регуляции белка-рецептора — соответствующий гормон. Это вещество связывают с подходящим нерастворимым гидрофильным носителем, и полученный материал используют при хроматографии как стационарную фазу. Вещества такого типа часто сами оказываются большими природными макромолекулами, и приемы, используемые для соединения их с носителями, сходны с методами приготовления иммобилизованных ферментов [см. разд. 27.4.2 (5)]. Реакции, с помощью которых белки, содержащие аминогруппы или фенольные группировки, могут быть связаны с носителем на основе сшитого полиакриламида, содержащего некоторое число гидразидных или 4-аминоанилидных остатков (схемы 30, 31 Б — остаток белка). Хорошие результаты получены в тех случаях, [c.322]

Хроматография — совокупность методов и процессов разделения, анализа и физико-химических исследований смесей растворенных веществ, где используются разделяющая среда (неподвижная фаза) и какой-либо растворитель (подвижная фаза). Основана на различии в скоростях перемещения концентрационных зон исследуемых компонентов в потоке подвижной фазы относительно слоя неподвижной фазы. Обязательным и необходимым условием хроматографического разделения компонентов смесей является различие в равновесном и кинетическом распределениях этих компонентов между фазами, адсорбционная X. — вид хроматофафии, основанный на различной избирательной сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом аффинная X. (биоаффинная X., биоспецифическая X., хроматография по сродству) — метод хроматографии, основанный на специфическом взаимодействии разделяемых биологически активных соединений с лигандами, ковалентно связанными с нерастворимыми носителями [c.343]

В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. Если иммобилизовать один из компонентов комплекса, то получится специфический сорбент для второго его компонента, при этом, разумеется, предполагается, что соблюдаются все условия, необ.ходимые для образования этого комплекса. Связывающие участки иммобилизованных веществ должны сохранять хорошую стерическую доступность для второго участника комплекса даже после связывания с нерастворимым носителем и не должны деформироваться. Примерами первых специфических сорбентов, приготовленных путем ковалентного связывания с нерастворимым носителем, были иммобилизованные антигены (Кемпбелл и др. [5]) . Методы, созданные для присоединения антигенов и антител к нерастворимым носителям, были сразу же применены для получения иммобилизованных ферментов. В то же время ранее предложенный азидный способ привязки ферментов к целлюлозе [25] стал использоваться для приготовления иммуносорбентов. Параллельное развитие обоих направлений, основанных на использовании связывания биологически активных веществ с нерастворимыми носителями, наглядно демонстрируют названия первых обзорных статей Реакционноспособные полимеры и их использование для приготовления смол с антителами и ферментами (Манеке [23]), Водонерастворимые производные ферментов, антигенов и антител (Сильман и Качальский [39]) и Химия и использование производных целлюлозы для изучения биологических систем (Великий и Витол [47]). Оба направления продолжали развиваться параллельно и после открытия других более эффективных носителей и разработки методов связывания, позволяющих сохранять свойства иммобилизуемых веществ в растворе. [c.11]

Сорбент должен проявлять минимальную неспецифическую сорбцию. При приготовлении нерастворимого аффинного лиганда важно, чтобы он прикреплялся, к носителю только ковалентной связью, а молекулы аффинного лиганда, не связанные ковалентно, должны быть отмыты. Это трудно осуществить, если носитель сильно адсорбирует молекулы аффинного лиганда. Подобным об-разолц если выделяют вещества, образующие специфический и обратимый комплекс со связанным аффинным лигандом, важно, насколько это возможно, чтобы только эти вещества задерживались на колонке с нерастворимым аффинным сорбентом и только в виде специфического комплекса со связанным аффинным лигандом. Это является одной из причин, почему носители, которые содержат ионогенную группу, такие, как сополимер этилена с малеиновым ангидридом, у которого остается ряд свободных кар- боксильных групп после присоединения аффинного лиганда, никогда не будут столь широко применяться в аффинной хроматографии, как нейтральная агароза. [c.176]

Производные полиакрилгидразид-сефарозы ведут себя как идеальные нерастворимые носители для аффинной хроматографии. Они сохраняют свойства сефарозы, в особенности минимальное неспецифическое взаимодействие с белками, хорошие фильтрующие свойства и высокую пористость. Кроме того, они механически и химически устойчивы. Эти производные обладают также преимуществами акриламидных гелей. При нейтральных pH они не несут заряда и содержат большое число групп, способных модифицироваться. [c.216]

Для сорбции лучше всего образец выделяемого вещества растворять непосредственно в буфере, из которого будет производиться сорбция, и, если необходимо, проводить замену состава солей, присутствующих в образце, с помощью диализа или гель-фильтрации. Если вещество, образующее в данных условиях прочный комплекс с иммобилизованным аффинным лигандом, выделяют колоночной хроматографией, то объем образца, вводимого в колонку, может быть любым. Однако, если выделяют аффинной хроматографией вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, объем наносимого образца не должен превышать 5% удерживаемого объема, для того чтобы предотвратить элюирование выделяемого вещества неадсорбированным материалом. Если выделяют вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, его элюирование с колонки происходит часто даже без замены буфера. В этом случае выделяемое вещество получают в разбавленном растворе. Для иллюстрации сказанного можно сопоставить хроматографию химотрипсина на сефарозе с присоединенным метиловым эфиром е-аминокапронил-О-триптофана с хроматографией этого же вещества на сефарозе с непосредственно связанным метиловым эфиром О-триитофаиа (рис. 5.4) [8]. Для элюирования химотриисина с нерастворимого носителя, на котором ингибитор укреплен через е-аминокапроновую кислоту в качестве прострапственной группы, необходимо изменение pH, при этом фракция химотрипсина элюируется в виде острого пика. Если ингибитор присоединен непосредственно к нерастворимому носителю, его пространственная доступность понижена, и химотрипсин только замедляет свое движение через колонку. Фермент элюируется в значительно большем объеме, при том же pH, в непосредственной близости к неактивному материалу. [c.264]

Специфические сорбенты, использующие исключительные свойства биологически активных веществ образовывать специфические и обратимые комплексы, в огромной степени облегчают выделение ряда ферментов, их ингибиторов и кофакторов, антител и антигенов, лектинов, гликопротеинов, гликополисахаридов, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, жиров, транспортных и рецепторных белков, гормонов и их рецепторов, клеток и многих других соединений, как это представлено в обзорной табл. 11.1. Наряду с названием выделяемого вещества в таблице приведены также используемые аффинные лиганды, нерастворимые носители и пространственные группы, причем указано, аффинный лиганд или нерастворимая матрица модифицированы данной пространственной группой. Обзорная таблица включает выделения веществ как с помощью типичной биоаффинной хроматографии, так и с помощью гидрофобной или ковалентной хроматографии. [c.367]

Важным условием успешного проведения аффинной хроматографии является выбор подходящего нерастворимого носителя для получения сорбента. В обзорной статье Куатреказаса и [c.7]

Для выделения различных мембранных структур используется и аффинная хроматография. Принцип этого метода заключается в способности выделяемого вещества специфически связываться с лигандом, пришитым к нерастворимому носителю, при пропускании раствора через матрицу. В качестве последней применяют сефарозы (агарозные гели), активируемые путем связывания различных лигандов кофакторов, ингибиторов, субстратов мембранных белков-ферментов, лектинов в случае выделения гликопротеинов гормонов, бромциана, конканавалина А — соответственно при получении мембран, антител или целых клеток, Элюирование исследуемого вещества осуществляют в условиях диссоциации комплекса лиганд — вещество и сохранения нативной структуры выделяемого соединения. [c.221]

ФАП, действующие на поверхности клетки. В эту группу попадают ФАП, активность которых связана с их взаимодействием с рецепторами на поверхности мембран клеток-мищеней, а проникновения ФАП внутрь клетки не требуется (например, в случае полимерных производных некоторых гормонов). Сочетание ФАВ с носителем в данном случае должно проводиться так, чтобы они оставались активными и в связанном состоянии, т. е. сохранялась бы способность к взаимодействию с соответствующими рецепторами. Последнее означает сохранение зарядов в нужных точках молекулы ФАВ и возможность принятия ею необходимой конформации на рецепторе. Эти требования накладывают более жесткие ограничения на конструкцию узла связывания ФАВ с полимером, чем при гидролитическом механизме действия, так как многие функциональные группы необходимо сохранить ннтактными. Поэтому в большинстве случаев между полимером и ФАВ используют вставку , как при связывании лигандов с нерастворимым носителем при аффинной хроматографии. О молекулярном конструировании ФАП этого типа ( истинных полимерных лекарствах ) см. разд. 4.1. [c.38]

Смотреть страницы где упоминается термин Нерастворимые носители для аффинной хроматографии: [c.60] [c.182] [c.444] [c.60] [c.13] [c.64] [c.73] [c.127] [c.151] [c.174] [c.236] [c.265] [c.5] [c.8] [c.21] [c.31] [c.35] [c.103] [c.14] [c.188] [c.30]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология