Адсорбционная и аффинная хроматография

Целлобиазы ( -глюкозидазы), как правило, имеют существенно более высокую молекулярную массу (120-180 кЛа), которая может в несколько раз возрастать за счет склонности фермента к ассоциации с образованием комплексов. Изоэлектрические точки многих целлобиаз лежат в близкой к нейтральной области, хотя большинство ферментов имеют р1 4,5-5,5. По адсорбционной способности целлобиазы значительно уступают другим компонентам целлюлазного комплекса, что позволяет выделять их методами аффинной хроматографии на целлюлозе. Биохимические характеристики ферментов из ряда микробных источников приведены в табл. 5.1. [c.121]

Тем не менее можно считать, что любому из возможных сочетаний фаз в двухфазных и трехфазных системах соответствуют определенные хроматографические методы. При этом возможны самые различные механизмы взаимодействия разделяемых веществ со стационарной твердой фазой, которые являются дополнительными классификационными признаками хроматографических методов в системе — жидкая твердая фаза адсорбционная, аффинная, гель-проникающая, ионообменная, лигандообменная и другие разновидности жидкостно-твердофазной хроматографии. [c.178]

Г. Адсорбционная и аффинная хроматография [c.390]

Адсорбционную хроматографию на угле, крахмале и других классических сорбентах вообще не применяют для разделения пептидов. Этот метод представлен здесь аффинной хроматографией, основанной на биоспецифической сорбции. Правда, аффинную хроматографию в основном применяют при выделении белков, однако метод может оказаться полезным при изучении физиологически активных пептидов. [c.390]

Поэтому постоянно велись и ведутся поиски новых, более совершенных методов разделения. В частности, различная адсорбционная способность даже очень близких по структуре соединений используется в адсорбционной хроматографии. Методы противоточного распределения, бумажной и жидко-жидкостной хроматографии основаны на различной растворимости компонентов смесей в двух несмешивающихся жидкостях. Различная растворимость газов в соответствующей жидкости и различная сорбция их твердыми носителями использованы при разработке методов газовой хроматографии. Различие электрических зарядов или констант электролитической диссоциации позволило разработать методы электромиграции (электрофореза) и ионообменной хроматографии. Наконец, самое новое направление, в котором используются специфические биохимические взаимодействия, по-видимому, позволит проводить избирательное выделение веществ посредством аффинной хроматографии. В результате разработки каждого из перечисленных направлений были созданы современные специализированные методы разделения, и цель настоящей книги познакомить с ними читателя. [c.12]

В хроматографии и родственных методах разделения используются различные процессы распределения веществ между двумя фазами, многократно повторяющиеся в элементарных пространствах [17, 21, 23]. Поэтому такие виды хроматографии, как ионообменная, распределительная, адсорбционная, аффинная и гель-проникающая, основанные на различиях в самых разных свойствах разделяемых веществ, можно проводить с помощью однотипного лабораторного оборудования. [c.191]

Фракции антител, специфичных к тяжелым цепям соответствующих иммуноглобулинов, получали, исходя из антисыворотки кролика или морской свинки, аффинной хроматографией на колонках, содержащих иммобилизованные подходящие Ig, индивидуальные или в смеси с другими белками (табл. 114-1). До проведения хроматографической очистки все антисыворотки анализировали с помощью иммунодиффузии. Для каждой антисыворотки подбирали подходящую колонку, проводя предварительные адсорбционные тесты с использованием соответствующих антигенов. [c.212]

Аффинная хроматография в тех случаях, когда она применима, особенно ценна для разделения биологических молекул, так как основана на их биологической специфичности. Теоретически этим методом можно добиться полной очистки и высокого выхода. Потенциальные возможности метода использованы далеко не полностью, особенно в отношении его применения для выделения больших количеств материала. Распределительную, адсорбционную и проникающую хроматографии на колонках для аналитических целей, как правило, не применяют вследствие их низкой разрешающей способности и значительных потерь материала. [c.139]

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

Тонкослойная хроматография является вариантом жидкостной хроматографии, протекающей в тонком слое сорбента, причем толщина слоя существенно меньше его ширины (не менее чем в 5 раз). В тонкослойной хроматографии используются те же варианты, что и в колоночной жидкостной хроматографии. По составу фаз, участвующих в процессе хроматографического разделения, можно выделить следующие основные виды тонкослойной хроматографии [2] жидкость—[твердое тело], жидкость — [жидкость — твердое тело] и жидкость—[гель]. Разделение может быть реализовано при использовании различных принципов удерживания, поэтому тонкослойная хроматография бывает адсорбционной, распределительной, ионообменной, молекулярно-ситовой и аффинной. [c.5]

В зависимости от природы процесса, обусловливающего распределение сорбатов между подвижной и неподвижной фазами, различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, осадочную, аффинную и эксклюзионную хроматографию (табл. 2). [c.8]

Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых разных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение таких методов часто позволяет получить наибольшую степень очистки белков, что в случае фе рментов означает максимально возможное повышение их удельной активности. Хотя колоночная хроматография служит идеальным способом оптимального разделения белков, не следует забывать и о методах адсорбции в объеме , так как это очень быстрые и потому весьма полезные методы, когда время имеет первостепенное значение (см. также гл. 7). Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники, фосфат кальция (в виде геля или в кристаллической форме) и разнообразные аффинные адсорбенты, созданные для ферментов определенных типов. Все эти вопросы вслед за общим введением в теорию адсорбционной хроматографии обсуждаются в данной главе применительно к выделению белков. [c.91]

АФФИННАЯ АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ [c.146]

Рис. 4.32. Основной принцип аффинной адсорбционной хроматографии. Лиганд Ь ковалентно присоединен к цепи носителя. Адсорбент связывает только молекулы фермента Е, обладающего специфическим сродством к Ь. Белки Р проходят через колонку, не связываясь с адсорбентом.

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

Основные виды. По механизму удерживания разделяемых в-в неподвижной фазой Ж. х. делится на осадочную xpo.ua-тографию, адсорбционную, распределительную, ионообменную хроматографию (в т. ч. ионную хро.матографию), ион-парную, лигандооб.иенную хроматографию, эксклюзион-ную хроматографию (ситовую) и аффинную хроматографию (биоспецнфическую). [c.151]

Таким образом, в аффинной хроматографии используется нерастворимый носитель, на котором иммобилизуется соединение, называемое лигандом он особым образом связывает подлежащий очистке продукт, находящийся в подвижной, обычно жидкой фазе. Лиганд иммобилизуют на носителе чаще всего посредством ковалентных связей, но иногда пользуются другими возможностями, такими, как ионный обмен, адсорбция, микроинкапсулирование и пр. Аффинная хроматография — это своего рода адсорбционная хроматография, при которой связывание происходит в соответствии со специфическими свойствами двух молекул. Эти свойства обусловливают взаимодействия различного характера — ионные, водородные, гидрофобные и др. в зависимости от конформации и размера молекул (рис. 3.3). [c.80]

По механизму взаимодействия сорбента и сорбата можно выделить несколько видов хроматофафии распределительнся хроматография основана на различии в растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе (газожидкостная матофафия) или на различии в растворимости веществ в подвижной и неподвижной жидких фазах ионообменная хроматография — на разной способности веществ к ионному обмену адсорбционная хроматография — на различии в адсорбируемости веществ твердым сорбентом эксклюзионная хроматография — на различии в размерах и формах молекул разделяемых веществ, аффинная хроматография — на специфических взаимодействиях, характерных дпя некоторых биологических и биохимических процессов. Существуют пары веществ, реагирующих в растворах с высокой избирательностью, например антитело и антиген, фермент и его субстрат или ингибитор, гормон и соответствующий рецептор, и т. п. Если одно из соединений пары удерживается ковалентной связью на [c.267]

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству)-в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов. [c.27]

Использование ступенчатых градиентов. Как отмечено в разд. 1.2.3 и на рис. 1.3, препаративную ЖХ можно использовать как быстрое средство выделения или обогащения классов соединений в условиях ступенчатого градиента. Иногда для простых смесей на этом может быть закончена необходимая очистка (см. пример на рис. 1.27). В других случаях для разделения сложного образца с компонентами, сильно отличающимися по полярности, может быть необходимо использовать многоступенчатую последовательность. Если оставить в стороне вопросы, связанные с растворимостью образца (см. разд. 1.6.2.2.6), то в адсорбционной ЖХ с помощью комбинации только четырех растворителей можно создать последовательность восьми градиентных ступеней и быстро разделить образец на фракции, которые затем можно индивидуально очистить в изократическом режиме. В каждой фракции спектр компонентов будет перекрывать диапазон к примерно только на 5—10 единиц. При скорости 1 мертвый объем в минуту процесс разделения, показанный в табл. 1.8, потенциально может быть закончен менее чем за 20 мин. Размер колонки может быть выбран в соответствии с имеющимся в наличии образцом. Для быстрого фракционирования образца можно аналогичным образом достаточно эффективно использовать градиентные схемы и в других методах разделения (ионный обмен, аффинная хроматография, распределение и т.д.). Классическая колоночная хроматография на открытых колонках часто выполнялась с использованием ступенчатого градиента, создаваемого элюотроп-ным рядом, подходящим для используемой неподвижной фазы. Однако, поскольку приготовление хорошей препаративной ЖХ-колонки требовало искусства и длительного времени. [c.100]

Варианты ЖТХ в зависимости от механизма удерживания разделяемых веществ твердой фазой жидкостно-адсорбционная хроматография (ЖАХ), ионообменная хроматография (ИОХ), аффинная хроматография, лигандообменная хроматография (ЛОХ), эксклюзи-онная, подразделяемая на гель-проникающую и гель-фильтрационную. [c.109]

Аффиная хроматография является самостоятельной областью жидкостно-адсорбционной хроматографии, выделяемой по специфическому механизму взаимодействия разделяемых веществ с сорбентом. Метод основан на характерной особенности биологически активньгх веществ селективно и обратимо связывать определенные вещества, называемые аффинными лигандами или аффиантами. Таким образом, ферменты связывают соответствующие ингибиторы, антитела — антигены, гормоны — их рецепторы и т.п. Если по аналогии с обращенными фазами приготовить сорбенты с привитыми аффинными лигандами, появляется возможность селективного хроматографического выделения близких по свойствам биологически активных соединений и их разделения между собой. Наиболее часто применяемые аффинные лиганды приведены в табл. 3.65. [c.201]

Несмотря на значительное число статей [6, 8, 10, 12—14], в которых эмпирически трактуется большинство варьирующих факторов, влияющих на результаты аффинной хроматографии, теоретические рекохмендации, основанные на физико-химических свойствах и закономерностях, очень редки. Наиболее конструктивна разработка Грейвсом и Ву [3] простых кинетических и равновесных моделей аффинной сорбции и десорбции. Анализировалась в отдельности адсорбционная и десорбционная фазы аффинной хроматографии, но в каждой фазе рассматривались в первую очередь ограничения, основанные на равновесных закономерностях, и не принимались во внимание кинетические процессы (диффузия и реакция). [c.20]

Отсюда следует, что, поскольку между ингибитором и ферментом образуется связь, в целом процесс очистки следует рассматривать скорее как осаждение, а не как хроматографию. Это может быть продемонстрировано изотермой адсорбции для аффинной хроматографии, приведенной на рис. 5.1 суммарная изотерма адсорбции (5) может быть определена как сумма изотерм специфической (1) и неспецифической (2) адсорбции. Специфическая изотерма адсорбции характеризует идеальную специфическую сорбцию с постоянной и относительно высокой адсорбционной энергией АО для всех адсорбируемых частиц. Сорбция прекращается, когда все доступные аффинантные центры заняты. [c.63]

Адсорбционная хроматография. Разделение в адсорбционной хроматографии основано на различиях в адсорбционной способности молекул на поверхности полярных минеральных носителей. Под адсорбционными понимаются взаимодействия между полярной поверхностью сорбента и полярными фрагментами молекул или ионов. Согласно принятой классификации межмолекулярных взаимодействий в хроматографии [31], адсорбционная способность молекул определяется совокупностью неспецифических (дисперсионных и индукционных взаимодействий) и специфических (диполь-дипольных, донорно-акцепторных, межионных взаимодействий, а также образованием координационной и водородной связей). Неспецифические взаимодействия в той или иной степени характерны для всех вариантов жидкостной хроматографии, тогда как преобладание определенного вида специфических взаимодействий позволяет выделять соответствующую систему в отдельный вариант жидкостной хроматографии. Так, образование координационных связей характерно для комплексообразовательной и лигандообменной хроматографии, а преобладание межионных взаимодействий позволяет говорить о разделении по механизму ионообменной хроматографии. Слож11ые специфические взаимодействия типа фермент — субстрат или антиген — антитело характерны для аффинной хроматографии. Такая ситуация привела к тому, что в последние годы под адсорбционной хроматографией все чаще подразумевают разделение органических молекул на поверхности минеральных носителей типа силикагеля, оксидов алюминия, титана и циркония. [c.364]

Описанный метод получил дальнейшее развитие, и на его основе был разработан прием аффинной хроматографии [122], который сводится к тому, что в буферный раствор добавляют лиганд, изменяющий адсорбционные характеристики. Будь то гидрофобные адсорбенты или агароза, принципы аффинной хроматографии остаются теми же, что и в случае использования более специфических адсорбентов (разд. 4.5) или ионообменников (разд. 4.4). Сначала в отсутствие лиганда находят условия, которых еще не вполне достаточно, чтобы вызвать нужный эффект (в данном случае элюцию). Затем добавляют лиганд, что слегка нарушает установившееся равновесие и приводит к ожидаемому эффекту. Важно, чтобы при добавлении лиганда происходило заметное изменение существенного для очистки свойства, в данном случае — гидрофобного взаимодействия. Лиганд должен сохранять способность связываться с ферментом в условиях, существующих в колонке, т. е. при высокой концентрации соли. Примером аффинного осаждения может служить очистка некоторых тРНК-аминотрансфераз [122] связывание крупной молекулы тРНК приводит к заметному снижению адсорбционной способности колонки, что позволяет осуществлять элюирование. [c.187]

Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше —10° С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу относится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Этот метод был введен в химию ферментов А. Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию ферментологии. Сейчас адсорбционный метод вьщеления и очистки ферментов разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит. электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Oiona из остроумнейших модификаций адсорбционного метода—аффинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, исследуемый фермент элюируют с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноэтапную (аффинная сорбция—элюция) схему выделения. [c.97]

В книге дан подробный анализ современных технических приемов хроматографии и возможностей н0ве11Ш011 аппаратуры, а также полный справочный материал по обменникам и сорбентам.. Анализируются последние достижения в гель-фил5,трации, распределительно , адсорбционно , ионообменной, аффинной и тонкослойной хроматографии. В каждом из методов наряду с обычно хроматографией рассмотрены достижения ыетодов высокоэффективной хроматографии при высоком давлении в колонках и на микропластинках. [c.2]

Сущность и классификапия методов хроматографии. Элюаци-онная (проявительная), фронтальная, вытеснительная, электрохроматография молекулярная, ионная, надмолекулярная адсорбционная, распределительная, ионообменная, осадочная, аффинная, эксклюзионная газовая и жидкостная хроматографии аналитическая, неаналитическая, препаративная и промышленная. [c.145]

Хроматография — совокупность методов и процессов разделения, анализа и физико-химических исследований смесей растворенных веществ, где используются разделяющая среда (неподвижная фаза) и какой-либо растворитель (подвижная фаза). Основана на различии в скоростях перемещения концентрационных зон исследуемых компонентов в потоке подвижной фазы относительно слоя неподвижной фазы. Обязательным и необходимым условием хроматографического разделения компонентов смесей является различие в равновесном и кинетическом распределениях этих компонентов между фазами, адсорбционная X. — вид хроматофафии, основанный на различной избирательной сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом аффинная X. (биоаффинная X., биоспецифическая X., хроматография по сродству) — метод хроматографии, основанный на специфическом взаимодействии разделяемых биологически активных соединений с лигандами, ковалентно связанными с нерастворимыми носителями [c.343]

Чтобы не путать с предыдущим разделом, этот раздел, в котором описано то, что обычно понимается под названием аф- финная хроматография , озаглавлен Аффинная адсорбционная хроматография . В этом случае биоспецифический отбор происходит на стадии адсорбции, так как выделяемый белок обладает специфическим сродством к адсорбенту благодаря его способности связывать лиганд (рис. 4.32). Нет четкого разделения между действительно специфическими аффинными адсорбентами, которые кроме белков, имеющих центры связывания для иммобилизованного лиганда, связывают мало других белков, и адсорбентами общего типа, которые хотя и проявляют специфичность к определенным классам белков, связывают также и многие другие. Описание адсорбентов второго типа можно начать сокращенных адсорбентов, обладающих значительной избирательностью к ферментам, имеющим нуклеотидсвязывающие центры, а затем перейти к таким адсорбентам, как фосфоцеллюлоза, которая, будучи в основном ионообменником, часто используется в качестве псевдоаффинного носителя для белков, связывающих нуклеиновые кислоты [70], и ферментов, взаимодействующих с фосфорилированными сахарами [62, 63]. Хотя [c.146]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология