Нуклеиновые кислоты, аффинная хроматография

Эта глава посвящена разделению нуклеиновых кислот и их компонентов с помощью тонкослойной, ионообменной и аффинной хроматографии, а также электрофореза на бумаге и в геле. Основные сведения об этих молекулах, в том числе их биологической роли и строении, можно почерпнуть из книг Биохимия нуклеиновых кислот [1] и Молекулярная биология гена [2]. Для более подробного ознакомления с практическими и теоретическими аспектами рассматриваемых в этой главе проблем можно обратиться либо к цитируемой литературе, либо к сборникам Техника лабораторных работ в биохимии и молекулярной биологии [3—6]. [c.162]

Заканчивая рассмотрение аффинной хроматографии белков, необходимо отметить, что вне поля нашего зрения осталась родственная область приготовления и использования иммобилизованных ферментов. Многое из того, что было сказано о способах посадки лигандов на активированные матрицы, имеет к этой области прямое отношение. Однако к кругу физико-химических методов исследования белков и нуклеиновых кислот использование иммобилизованных ферментов имеет лишь косвенное отношение, так что за недостатком места мы на нем остановиться не сможем. [c.435]

Для иллюстрации изложенных в предыдущем разделе обш их соображений и возможностей использования различных аффинных сорбентов рассмотрим определенное число примеров, отобранных из периодической научной литературы последних трех лет. Большая их часть относится к очистке ферментов клеточного метаболизма (и отдельно — белков, регулирующ,их активность нуклеиновых кислот). Далее будут приведены примеры аффинного фракционирования и очистки самих нуклеиновых кислот, в том числе на иммуносорбентах. Основное внимание уделим более простому и универсальному методу — неспецифической элюции, однако био-снецифическая аффинная элюция белков тоже будет представлена несколькими типичными примерами. Рассмотрение начнем с использования сорбентов с индивидуальной специфичностью, ограничившись здесь тремя примерами, поскольку нет смысла пытаться сколько-нибудь полно иллюстрировать бесчисленное разнообразие возможных сорбентов этого типа. Аффинная хроматография белков клеточного метаболизма на сорбентах с групповой специфичностью будет иллюстрирована подробнее, а затем последуют два примера использования ковалентной хроматографии. [c.412]

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугирования и декантации. Эти методы рассмотрены ниже наряду с аффинной хроматографией на колонках. [c.11]

Полученные так суммарные препараты нуклеиновых кислот фракционируют далее, используя более тонкие методы, такие, как хроматография, в том числе аффинная, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, распределение в двухфазных полимерных системах, ультрацентрифугирование, электрофорез и др. Большинство этих методов рассмотрено в гл. II и при работе с нуклеиновыми кислотами отличается лишь в деталях. В итоге получают препараты индивидуальных нуклеиновых кислот. [c.190]

АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.435]

Весьма важное место принадлежит аффинной хроматографии [116, 117]. Она основана на использовании особых адсорбентов, специфически взаимодействующих с макромолекулами и избирательно удерживающих данный вид макромолекул (отсюда и название метода). Примером, о котором уже говорилось в разд. Г.10, служит адсорбция комплементарных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты на иммобилизованной ДНК. Аффинная хроматография используется также для очистки ферментов, антител и других белков, способных прочно связываться со специфическими малыми молекулами. [c.161]

Слабое основание. Можно диазотировать и присоединять белки, нуклеиновые кислоты и т. д. носитель для аффинной хроматографии. — 0,15-0,2 9 Размер частиц 50-200 мкм. ц. [c.435]

Как было показано выше, целлюлоза была первым носителем в аффинной хроматографии. Обзор данных по применению целлюлозы для выделения антител и антигенов приведен в работе [81]. Данные о ковалентном связывании нуклеотидов, полинуклеотидов и нуклеиновых кислот обобщены в статье [33]. Хотя в настоящее время в аффинной хроматографии применяются и другие твердые носители, целлюлоза не потеряла своего значения. Трипсин, связанный с целлюлозой, по-прежнему ис- [c.40]

Аффинная хроматография — один из главных методов очистки белков — основана на взаимодействии между двумя биологически активными веществами, одно из которых обычно ковалентно присоединено к инертному носителю. Аффинная хроматография используется для очистки белков — антител, ферментов, гормонов, рецепторов — и других биополимеров — полисахаридов и нуклеиновых кислот, а также биологических макрочастиц, например вирусов и клеток. [c.180]

Разрешающая способность этого метода аффинной хроматографии для нуклеиновых кислот в большинстве случаев превосходит результаты фракционирования ДНК в градиенте плотности в присутствии лигандов, специфичных к парам оснований. [c.177]

Когда генетические вариации отсутствуют или не удовлетворяют требованиям опыта, иногда применяется избирательная химическая модификация. Некоторые аминокислотные остатки могут быть избирательно модифицированы в присутствии остальных. Даже если в белке имеется много экземпляров остатков каждого типа, часто лишь ограниченное их число обладает высокой реакционной способностью. Если в результате модификации структура или функция белка изменяются, можно попытаться объяснить, каким образом эта модификация привела к такому результату. В случае нуклеиновых кислот осуществление специфической химической модификации затруднительно, поскольку здесь гораздо меньше видов звеньев, а химические свойства всех звеньев, к сожалению, очень близки. И все же существуют приемы, способные упростить задачу. Предположим, что в результате модификации получается гетерогенная смесь молекул, прореагировавших в нескольких различных местах. Вероятно, некоторые из этих молекул будут инактивированы, а другие сохранят нормальную функцию. Тогда можно будет с помощью физических методов, основанных на способности молекул к функционированию (например, с помощью аффинной хроматографии), разделить полученную смесь. На практике получение химически модифицированных макромолекул является нередко трудоемкой процедурой, проводимой методом проб и ошибок. Тем не менее использование таких макромолекул необходимо для ряда других методов, таких, как метод зондов или меток, а также для изоморфного замещения тяжелыми атомами при изучении больших молекул методом рентгеновской кристаллографии. [c.40]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

Есть еще одна особенность аффинной хроматографии, которую следует отметить с самого начала. Способ связывания биологически активного лиганда с матрицей обязан не только обеспечивать сохранение его активности, по п не создавать стерических препятствий для взаимодействия сорбируемого вещества с лигандом. Когда в качестве лиганда выступает биополимер (белковый антиген или субстрат, нуклеиновая кислота) и его участок биоспецифического взаимодействия оказывается достаточно удаленным от точки закреплетшя па матрице, то эта проблема не возникает. [c.341]

Кислый аминополисахарид гепарин [М> 10 ООО) известен в качестве антикоагулянта крови. Кроме того, он применяется в биохимии как ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому-отражает некоторое сходство полимера, содержащего две-три суль, фогруппы на каждую дисахаридную структурную единицу, с РНК-Две эти особенности определили использование гепарина в качеств, лиганда для аффинной хроматографии факторов коагуляции крове и (особенно широко) для очистки белков, взаимодействующих и нуклеиновыми кислотами (полимераз, обратной транскриптазы, рес стриктаз, факторов инициации и элонгации белкового синтеза и др.). Кроме того, иммобилизованный гепарин связывает липопротеид-липазы и некоторые липопротеиды. Гепарин-агароза выпускается всеми упомянутыми фирмами-поставщиками аффинных сорбентов, кроме Bio-Rad . [c.370]

Аффинная хроматография НК на сорбентах, лигандами которых являются тоже нуклеиновые кислоты, базируется на их комплементарном взаимодействии с образованием достаточно прочных двунитевых структур — двунитевых ДНК и РНК нли ДНК—РНК-гибридов. Такие структуры образуются и надежно сохраняются лишь тогда, когда строго комплементарные участки имеют протяженность в десятки нуклеотидных звеньев. Эта степень соответствия не может быть случайной, а реализуется только в том случае, когда одна из НК была синтезирована по матрице второй НК (или ей идентичной). Разумеется, как иммобилизованная НК, так и очищаемая должны быть однонитевыми, а условия связывания с сорбентом должны быть благоприятными для их гибридизации. [c.441]

Лиганд. Любая молекула, низкомолекулярная или высокомолекулярная, способная специфически взаимодействовать с белком, нуклеиновой кислотой или другой молекулой, которую нужно очистить, потенциально может быть пригодна в качестве лиганда для аффинной хроматографии. Многие лиганды, такие, как субстраты ферментов, лектины или антигены, взаимодействуют только с одним типом белка или по крайней мере с очень ограниченным кругом белков. Другие, такие, как коферменты (NAD, NADP), нуклеотиды (АТР, АМР, сАМР и т. д.) и иммобилизованные красители, специфически взаимодействуют с более широким, хотя и ограниченным кругом макромолекул и известны как группспецифические лиганды. [c.445]

Агарозные гранулированные гели применяют для выделения и фракционирования очень крупных молекул, в том числе вирусов, бактериофагов, субклеточных частиц (например рибосом), белков, нуклеопротеидов, нуклеиновых кислот, полисахаридов, Ог других мягких гелей агарозы отличает болёе широкие интервалы фракционирования. Агарозы используют также в качестве носителей иоспецифических сррбентов для аффинной хроматографии (см. разд. 120), [c.62]

Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помошью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее характерных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела— с антигенами (против которых получены), а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т. д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография. [c.9]

По своей сути аффинная хроматография — идеальный метод для изучения взаимодействий в биохимических процессах. Иммобилизованная лейцил-тРНК-синтетаза использована как для выделения изолейцил-тРНК, так и для изучения взаимодействия белка с нуклеиновой кислотой [10]. Взаимодействия пептидов с белками [12] и нуклеотидов с аминокислотами и пептидами [20] [c.17]

Чтобы не путать с предыдущим разделом, этот раздел, в котором описано то, что обычно понимается под названием аф- финная хроматография , озаглавлен Аффинная адсорбционная хроматография . В этом случае биоспецифический отбор происходит на стадии адсорбции, так как выделяемый белок обладает специфическим сродством к адсорбенту благодаря его способности связывать лиганд (рис. 4.32). Нет четкого разделения между действительно специфическими аффинными адсорбентами, которые кроме белков, имеющих центры связывания для иммобилизованного лиганда, связывают мало других белков, и адсорбентами общего типа, которые хотя и проявляют специфичность к определенным классам белков, связывают также и многие другие. Описание адсорбентов второго типа можно начать сокращенных адсорбентов, обладающих значительной избирательностью к ферментам, имеющим нуклеотидсвязывающие центры, а затем перейти к таким адсорбентам, как фосфоцеллюлоза, которая, будучи в основном ионообменником, часто используется в качестве псевдоаффинного носителя для белков, связывающих нуклеиновые кислоты [70], и ферментов, взаимодействующих с фосфорилированными сахарами [62, 63]. Хотя [c.146]

Обзор связанных аффинных лигандов, иреимущественно белковой природы, на целлюлозе п ее производных сделан Сильма-ном и Качальским [67], обзор связывания ферментов — Круком и сотр. [11], а связывания нуклеотидов, полинуклеотидов и нуклеиновых кислот — Гиламом [22]. В этих обзорах упомянуто много различных методов связывания. Поскольку в настоящее время целлюлоза находит ограниченное использование в аффинной хроматографии, здесь кратко отмечаются только некоторые из методов связывания. [c.178]

Области применения аффинной хроматографии расширяются, поокольку метод основан на специфических взаимодействиях биологически активных веществ. Как видно из табл. 11.1, этот метод успешно используется при выделении самых разных соединений. Наряду с этим он полезен при изучении различных систем на аффинных сорбентах можно разделять низкомолекулярные энан-тиомеры и удалять нежелательные вещества из живых организмов. -Например, аффинной хроматографией можно разделить на оптические антиподы 0,Ь-триптофан. Используя специфическое выделение меченых пептидов, можно определить пептиды активного центра фермента, связывающего участка антител или участка пептидных цепей на поверхности молекулы. Аффинная хроматография может быть использована для изучения возможности замены природных пептидных цепей ферментов различными модифицированными синтетическими пептидами. Активные центры ферментов или антител, связывающие свойства субъединиц, специфичность ферментов по отношению к различным ингибиторам, комплементарность нуклеиновых кислот, взаимодействие нуклеотидов с пептидами, влияние присутствия различных соединений на образование специфических комплексов и т. д. могут быть исследованы с помощью аффинной хроматографии. [c.282]

Специфические сорбенты, использующие исключительные свойства биологически активных веществ образовывать специфические и обратимые комплексы, в огромной степени облегчают выделение ряда ферментов, их ингибиторов и кофакторов, антител и антигенов, лектинов, гликопротеинов, гликополисахаридов, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, жиров, транспортных и рецепторных белков, гормонов и их рецепторов, клеток и многих других соединений, как это представлено в обзорной табл. 11.1. Наряду с названием выделяемого вещества в таблице приведены также используемые аффинные лиганды, нерастворимые носители и пространственные группы, причем указано, аффинный лиганд или нерастворимая матрица модифицированы данной пространственной группой. Обзорная таблица включает выделения веществ как с помощью типичной биоаффинной хроматографии, так и с помощью гидрофобной или ковалентной хроматографии. [c.367]

Недавно было показано, что нуклеопротеиды [147] и другие белки [148], разделенные с помощью гель-электрофореза, можно перенести на нитроцеллюлозные или диазобензилоксиметилцел-люлозные фильтры. Более того, белки после такой процедуры сохраняют способность связываться с ДНК [148]. С помощью этого метода, по-видимому, можно выделить и охарактеризовать белки, взаимодействующие с ДНК или РНК. В работе [149] показано, что /ас-репрессор из Е. соИ специфически удерживается на колонке с диазобензилоксиметилцеллюлозой, содержащей ковалентно связанные фрагменты /ас-оператора Е. соН. В отличие от электрофоретического разделения, которое требует соблюдения весьма специфических условий, этот тип аффинной хроматографии идеально подходит для изучения влияния ионной силы, pH и температуры на эффективность взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Такого рода аффинную хроматографию, вероятно, можно использовать для очистки белков, контролирующих экспрессию генов. [c.196]

Лучшим доказательством огромных возможностей данного метода является постоянное увеличение числа ферментов и других белков, очистку которых проводят методом аффинной хроматографии. Характерно, что в число таких ферментов входят и некоторые аллостерические ферменты, такие, например, как глутаминсинтетаза. Кроме того, аффинная хроматография применяется для очистки антител, антигенов и нуклеиновых кислот. Одной из важнейших областей применения метода становится изучение гормонов и рецепторов лекарственных веществ, а также сложных клеточных структур, анализ которых до настоящего времени был в значительной степени затруднен. [c.104]

Высокую эффективность ФР II скорее всего следует отнести за счет возможного участия аффинных взаимодействий рестриктаз с этим сорбентом. В этом отношении больший интерес представляют данные, полученные с применением другого аффинного катионита — ГС. Ее использование на первых хроматографических стадиях выделения, последовавших после удалё-ния нуклеиновых кислот, дало 20-ти кратную [118, 302], 75-ти кратную [299] и 100-кратную [33] очистку. Выходы целевых ферментов во всех цитированных случаях превышали 80%. Только в случае выделения рестриктазы SalG I очистка и выход равнялись соответственно 3-кратной и 30% [177]. Однако в этом случае хроматография на ГС осуществлялась на предпоследней стадии и дала препарат, в котором больше чем половина белка приходилась на рестриктазу SalG I. Поэтому эти данные нельзя рассматривать, как свидетельствующие о низкой эффективности ГС в случае очистки указанного фермента. [c.169]