Пептиды, элюирование

Я есть отпечатки пальцев . При соблюдении постоянства всех режимов и стандартности материалов картина отпечатков пальцев поразительно воспроизводима. Положения всех пятен на листе повторяются от опыта к опыту с точностью до 3—5 мм. Кроме того, проявление нингидринной окраски в мягких условиях приводит к химическому разрушению лишь небольшой части каждого пептида. Поэтому каждое пятно может быть вырезано и каждый пептид элюирован горячей водой и собран с минимальными потерями в виде отдельной фракции. [c.27]

В этой главе рассмотрены наиболее важные конструкционные особенности ГФ-секвенатора, особенности методик, с успехом применяющихся для анализа структуры на микроуровне (<100 пмоль) пептидов, элюированных из ДСН-полиакрил-амидных гелей (ДСН—ПААГ). [c.465]

Антигенные пептиды, элюированные из комплекса с молекулами МНС класса I [c.162]

Таким образом, к категории слабых могут быть отнесены ионообменники, значительно отличающиеся друг от друга. Для них характерно не толыко сужение рабочего диапазона pH, но и уменьшение прочности сорбции вещества внутри этого диапазона. Слабым ионообменникам, в частности анионитам с замещающими группами диэтиламиноэтила (ДЕАЕ), отдают предпочтение в тех случаях, когда необходимо элюирование в мягких условиях, например, при разделении белков и пептидов. [c.35]

Уравнение (4.52) используется в литературе значительно реже, чем (4.46), однако, по нашему мнению, для пренебрежения им нет достаточных оснований. Мы использовали уравнение (4.52) для описания удерживания самых разнообразных классов соединений — алканов, алкилбензолов, алифатических кетонов, спиртов, производных адамантана, дигидропиридина, 5-фторурацила, циклопентанона, пептидов. Некоторые примеры зависимостей (4.52) представлены на рис. 4.13. Во всех случаях отклонение экспериментальных данных от прямых (4.52) было сопоставимо с погрешностью определения Ig . В пользу уравнения (4.52) свидетельствует также то обстоятельство, что числовые значения коэффициента р находятся в качественном соответствии со сравнительными размерами молекул сорбатов и органических модификаторов. Так, по данным [307], при элюировании бензола его молекула вытесняет около 6 молекул метанола, 4,5 молекулы этанола, 3 молекулы пропанола-2. В табл. 4.14 приведены параметры уравнения (4.52) для углеводородов, алкилбензолов и различных кислородсодержащих соединений. В качестве неподвижной фазы использован Зорбакс ODS, подвижная фаза состояла из ацетонитрила и воды в различных соотношениях. В гомологических рядах введение двух метиленовых групп приводило к увеличению параметра р примерно [c.94]

Имеются несколько методов автоматического определения аминокислотных остатков в продуктах гидролиза пептидов, которые основаны на ионообменных методах с градиентным элюированием [43—45]. Соответствующие устройства, обеспечивающие создание непрерывных градиентов буферного раствора, применяли также и в анализе остатков сахаров [48, 49]. [c.388]

Элюат, полученный в результате промывания колонки дистиллированной водой после нанесения материала перед элюированием 0,1 н. НС1, содержит нейтральные и основные компоненты фракционируемой смеси пептидов. [c.196]

Если элюирование основных пептидов происходит слишком быстро, т. е. они выходят практически одной большой фракцией, следует сделать градиент концентрации более пологим . Для этого можно либо увеличить объем смесителя, либо уменьшить концентрацию уксусной кислоты. [c.197]

При промывании колонки дистиллированной водой после нанесения образца перед началом элюирования кислотой выходит весьма разбавленный элюат, содержащий нейтральные и кислые компоненты смеси пептидов. [c.197]

НС1 буферах, содержащих 6—8М раствор мочевины. Элюирование пептидов осуществляется прн постепенном повышении ионной силы раствора. [c.54]

Рис 5-19 Масс-хроматограммы пептидов (331 Колонка 50 мм х 4 1 (внутр диам) неподвижная фаза силикагель модифицированный ОДС (3 мкм) подвижная фаза ацетонитрил/0 I моль/л водный раствор ацетата аммония элюирование градиентное (концентрация ацетонитрила меняется в процес се разделения от 30 до 50%) [c.142]

В качестве иллюстрации применения градиентного элюирования упомянем разделение аминокислот, пептидов и сахаров по [c.560]

Система с градиентным элюированием обладает рядом преимуществ по сравнению с методом тонкослойной хроматографии. Во-первых, сводится к минимуму возможность ошибки, поскольку разделение идет в стандартных условиях, а полученные результаты можно контролировать методом ТСХ. Во-вторых, этот метод позволяет выявлять необычные аминокислоты или устойчивые к гидролизу пептиды, что в некоторых случаях представляет большой интерес. Как показано на рис. 33.8, на одной колонке удается разделить все обычные аминокислоты, а при соблюдении стандартных условий провести и количественный анализ. Однако эти преимущества достигаются благодаря применению более сложного оборудования и больших количеств веществ (по крайней мере, вдвое по сравнению с ТСХ). [c.377]

К раствору пептида объемом 0,1 —1,0 мл добавляют 1 мл раствора нингидрина (гл. 32) пробирку закрывают колпачком, встряхивают и нагревают на прикрытой кипящей водяной бане в течение 15 мин. После развития окраски разбавляют до нужного объема 50%-ным этанолом, охлаждают до 30 °С и измеряют экстинкцию при 570 нм. Нингидриновый реактив готовят на достаточно концентрированном буферном растворе (гл. 32), который обеспечивает сохранение оптимального значения pH 5,5. Степень разведения (50%-ным этанолом) зависит от концентрации пептида. Иногда в раствор для разведения добавляют немного бензола, но в таких случаях для предотвращения опалесценции увеличивают концентрацию этанола до 60%. Интенсивность окраски пересчитывают на лейциновый эквивалент , т. е. указывают содержание лейцина (в ммолях), дающего в аналогичных условиях равную интенсивность окраски. По полученным результатам строят профиль элюирования, где на оси абсцисс откладывают объем в миллилитрах, а на оси ординат— соответствующий лейциновый эквивалент, или оптическую плотность при 570 нм. [c.392]

Слабоосновные пептиды фракционируют в буферных растворах с pH 6,5—7,0, т. е. в той области, где аминогруппа заряжена частично. В этой области pH амберлит ШС-50 обладает высокой буферной емкостью, что препятствует элюированию со сменой pH. Поэтому фракционирование проводят в градиенте ионной силы, но при постоянном значении pH. Постоянства pH достигают применением фосфатных буферных растворов градиент ионной силы задают путем повышения концентрации фосфата или хлорида натрия. Разделение пептидов происходит в данном случае благодаря сочетанию двух факторов ионного [c.408]

Иониты этого типа находят широкое применение при фракционировании белков и крупных пептидов. Последние часто хроматографируют в присутствии 8 М мочевины или 6 М гуанидин-хлоргидрата. При выборе ионита и условий элюирования руководствуются общими правилами, применяемыми при разделении белков (гл. 35). [c.411]

Элюирование проводили в градиенте хлорида натрия на фоне исходного буфера. Общие выводы относительно эффективности разделения в градиенте этого типа, а также рекомендации относительно оптимальных условий разделения (с указанием объема колонки и наклона градиента) той или иной смеси пептидов можно найти в работе 44]. [c.415]

Совершенно не ясно, каким образом вообще осуществляется взаимодействие между набухающими в воде гелями и ароматическими соединениями. Этот эффект можно подавить, вводя в элюент различные добавки. Создавая в элюенте высокую концентрацию роданида или мочевины, удается почти полностью нормализовать элюирование пикриновой кислоты и триптофана [52]. На сефадексе 0-25 в водно-спиртовой среде полифенолы ведут себя в соответствии с их молекулярным весом, ВТО время как в чистой воде они сильно задерживаются гелем [53]. Возможные активные центры геля не удается насытить путем добавления к элюенту ароматических соединений (например, 0,2 н. салицилата натрия) [42], однако в 1 М пиридине ди-нитрофенильные производные аминокислот появляются в элюате раньше, чем свободные аминокислоты. По-видимому, при хроматографировании в системе фенол — уксусная кислота — вода (1 1 1) гель уже не имеет сродства к ароматическим соединениям [54], Карнеги [55], работая на сефадексе 0-25 в этой системе (которая позволяет избежать побочных эффектов), сумел на ряде пептидов подтвердить обычную зависимость между объемами выхода и молекулярным весом (табл. 26). Он предполагает, что при молекулярном весе выше 400 имеет место собственно гель-хроматография, поскольку здесь уже не должен действовать эффект распределения [63]. Однако до сих пор все же не доказано, одинаков ли состав растворителя в гранулах геля и между гранулами. [c.130]

Применение метода газовой хроматографии альдегидов, образующихся из аминокислот при реакции с нингидрином, ограничивается определением нейтральных аминокислот (Хантер, 1956 Златкис, 1960). Метод газожидкостной хроматографии н- и изоамиловых эфиров N-аце-тиламинокислот при сравнительно низких температурах (95—148 °С) был применен при анализе гидролизатов коротких пептидов, элюированных с бумажных хроматограмм (Мейстер, 1961). Этот метод является чрезвычайно перспективным. [c.642]

Для динитрофонилирования микроколичеств пептидов, элюированных из хроматограммы, рекомендуется метод Запгера и Томпсона [2], которые ири динитрофенилировании заменяли бикарбонат на триметил-амин (Я 9о). [c.474]

Пептидные фрагменты, появившиеся в результате процессинга антигена и экспонируемые затем АПК в ассоциации с молекулами МНС, можно получить в виде очищенных препаратов и секве-нировать. Среди них встречаются не только пептиды из поглощенного клеткой чужеродного антигена (например, вирусных частиц), но и собственные пептиды организма, отщепившиеся в АПК или эндоцитированные ею из внеклеточной жидкости. Анализ (путем очистки и секвенирования) этих собственных пептидов, элюированных из комплексов с молекулами МНС класса I, показал, что они состоят из девяти аминокислотных остатков при этом удалось точно установить структуру ряда таких пептидов и идентифицировать характерные аминокислотные остатки — один на С-конце и другой ближе к N-концу. Этими характерными структурными мотивами различаются пептиды, связываемые молекулами класса I разных гаплотипов рис. 9.22). [c.161]

Аллоспецифичные структурные мотивы в молекулах пептидов, элюированных из комплексов с молекулами МНС класса I гаплотипа Н-2КЬ или Н-2К . Молекулы МНС вьщеляли методом иммунопреципитации. Связанные с ними пептиды были очищены и секвенированы. Якорные аминокислотные остатки, наиболее часто встречающиеся в определенных позициях, определены как доминантные, а встречающиеся лишь относительно часто - как функциональные. В позициях без указания определенной аминокислоты с равной вероятностью встречается несколько различных остатков. Для обозначения аминокислот использован однобуквенный код. Вверху изображены пептидсвя-зывающие полости (вид сверху) двух молекул МНС класса I разных гаплотипов. Позиции якорных остатков в составе пептида, связанного с молекулой МНС каждого гаплотипа, выделены цветом. [c.162]

Аллоспецифические структурные мотивы в составе пептидов, элюированных из комплекса с молекулами МНС масса II [c.163]

Загрязнения образца, обусловленные неподвижными фазами, являются результатами химической нестабильности или разрушения насадки или одновременного элюирования загрязнений, содержащихся в матрице насадки. Первая ситуация, вероятно, наблюдается при использовании привитых силикагелей или ионообменников (на основе смол или силикагеля). Например, почти все доступные сейчас привитые фазы на основе силикагеля получают с силоксановой связью —Si—О—Si— между матрицей силикагеля и привитой группой на поверхности. Хотя эта связь является термически стабильной (допускает использование определенных связанных фаз в газовой хроматографии), реакции, используемые для ее получения, обратимы [116, 117]. Эта часто не принимаемая во внимание характеристика обусловливает гидролитическую нестабильность, которая становится значительной в кислотных или щелочных условиях. Часто случается, что условия, ускоряющие гидролиз привитой фазы (например, очистка пептидов на ig с использованием водной подвижной фазы, содержащей трифтороуксусную кислоту при pH 2- 3), способствуют также удерживанию продуктов гидролиза на насадке (например, октадецилдиметилсиланол удерживается на is в водном растворе). При этом образуется in situ поверхностная фаза с разделительными свойствами, [c.75]

Хроматография. Пептиды фракционируют с помощью градиентного элюирования. Стартовый буферный раствор имеет pH 3,Ь Смеситель содержит 2500 мл 0,5 н. буферного раствора pH 5,1. Элюат, вытекающий из колонки, собирают фракциями по 10 мл-Нингидриновую реакцию ставят либо непосредственно с полученным элюатом, либо после его щелочного гидролиза. [c.198]

Разделение на фильтрах из геля сефадекса позволяет использовать различие в молекулярном весе [21, 24, 126, 127]. Этот метод по своей эффективности приблизительно соответствует диализу, но может быть осуществлен гораздо быстрее. Линднер и др. [128] экстрагировали сухой препарат задней доли гипофиза свиньи (активность окситоцина и вазопрессина 2—3 Е /мг) пиридиноацетагным буфером. После нейтралит зации раствор пропускали через колонку с сефадексом G-25, элюировали этим же буфером и получили две фракции, дающие положительную реакцию с нингидрином. Первая, более подвижная фракция содержит окситоцин и вазопрессин в виде комплексов пептид — белок вторую фракцию, состоящую из низкомолекулярных неактивных соединений, отбрасывали. Десятиминутная обработка первой фракции 1 М муравьиной кислотой при 70 приводит к диссоциации комплекса и при повторном пропускании через сефадекс G-25 и элюировании 1 М муравьиной кислотой получили медленно передвигающуюся фракцию вазопрессина и окситоцина с активностью приблизительно 100 Е мг. [c.409]

Рис 7-50 а - разделение смесн пептидов на капиллярной колонке с примене нием градиентного элюирования Колонка 1 мм (бнутр диам ) х 35 см, не подвижная фаза зорбакс BP-ODS (7 5 мкм) подвижная фаза ацетонит рил/водный раствор, содержащий 0,1% фосфорной кислоты и 10 ммоль/л ди-гидрофосфата калия (5/95) градиент 10 - 100% в течение 36 мин, обьемная скорость 80 мкл/мин, детект<ф УФ 214 нм объем пробы 5 мкл [c.208]

Идеальная матрица должна работать только по принципу молекулярного сита. Сшитые декстраны и полиакриламидные гели нельзя считать идеальными матрицами, и это необходимо учитывать при проведении эксперимента. Во-первых, эти материалы сильно сорбируют пептиды, содержащие остатки ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и фенилаланина). При элюировании буферными растворами, содержащими вещества ароматической природы, мочевину или роданид калия, адсорбция несколько снижается, однако полностью не исчезает. Известно также, что адсорбция на сефадексе несколько возрастает при увеличении ионной силы [19], однако удовлетворительного объяснения этому явлению не дано. Во-вторых, матрица содержит небольшое количество карбоксильных групп. Вследствие этого независимо от молекулярного веса пептидов может наблюдаться ускорение компонентов, несущих отрицательный заряд, и удерживание или необратимая адсорбция основных пептидов. Этот эффект подавляется в том случае, если ионная сила буферного раствора превышает 0,02. [c.396]

Пептиды наносят на колонку в 0,1—0,2 н. уксусной или муравьиной кислоте, в 0,2%-ном карбонате или бикарбонате аммония. Тип геля выбирают так, чтобы пептид появлялся на выходе колонки вблизи свободного объема. Для этой цели наиболее всего подходят сефадексы 0-10, 0-15, 0-25 и биогели Р-2 и Р-6. Объем образца не должен превышать 7з—74 от объема столбика геля (например, в случае сефадекса 0-25). Элюировать удобно летучими буферными растворами, хотя выбор буфера зависит от растворимости пептида. В случае необходимости обессоливание ведут в дистиллированной воде, однако при этом происходит расширение зон, которое может привести к их перекрыванию. Для достижения полного обессоливания необходимо увеличить столбик геля. В зависимости от объема выхода пептида, нагрузки на колонку и объема образца скорость элюирования составляет примерно 7—20 мл/ч см . При работе на сильиосшитых гелях рекомендуется несколько увеличить высоту столбика геля (по сравнению с сефадексом 0-25). Пептиды обнаруживают в элюате колориметрически, спектрофотометрически, а выделяют упариванием при пониженном давлении или лиофилизацией. [c.397]

Рис. 34.9. Профиль элюирования пептидов триптического гидролизата 5-ами-ноэтилнрованного белка Бенс-Джонса Ад на колонке (1,8X150 см) со смолой дауэкс 1-Х2 при 35 °С [31].

Рис. 34.12. Профиль элюирования пептидов триптического гидролизата к-типа белка Бенс-Джонса Ag (первая фракция после разделения на амберлите ШС-50, см. рис. 34.11) на колонке (1,8X150 см) со смолой дауэкс 50-Х2 в пиридин-ацетатных буферах [34].

При фракционировании белков обычно применяют иониты, содержащие карбоксиметильную и диэтиламиноэтильную функциональные группировки, однако эти иониты не вполне подходят для разделения пептидов. Как правило, почти все кислотные пептиды адсорбируются на катионите при pH 3,0—3,5 в буфер ном растворе с низкой ионной силой, откуда могут быть элюи рованы при рн 6—9 и при более высокой ионной силе. Карбо ксилсодержащие иониты слабо диссоциированы при pH 3, и следовательно, обладают пониженной емкостью. Кроме того в разбавленных электролитах, т. е. в условиях проведения сорб ции, слишком велика буферная емкость ионита. Скачкообразное изменение pH элюента приводит на практике к одновременному элюированию группы пептидов. Аналогичные недостатки свойственны ионитам с ВЕАЕ-группой, особенно при работе с летучими буферными растворами. Изменение ионной силы и значения pH во время элюирования вызывает сжатие столбика сорбента, нарушение скорости потока и искажение профиля элюирования. В наибольшей степени этот эффект выражен у ионитов на основе слабосшитых гелей, однако в какой-то степени это свойство характерно и для модифицированных целлюлоз. И тем не менее некоторые типы ионитов на основе целлюлозы находят применение для разделения небольших пептидов. К ним относятся фосфоцеллюлоза, ЗЕ-целлюлоза, 8Р-целлюлоза и РАЕ-сефадекс. [c.411]

Триптические пептиды а-и р-цепей гемоглобина хроматографировали в градиенте пиридин-ацетатных буферов [39]. При этом хроматографическое поведение пептидов в целом напоминало их поведение при разделении на смоле дауэкс-50, хотя в профилях элюирования наблюдались несомненные различия. Поэтому те пептиды, которые элюируются на смоле дауэкс-50 в одной зоне, можно разделить на фосфоцеллюлозе, и наоборот. На основании этой работы можно сделать определенные выводы относительно связи между хроматографическим поведением и структурой пептидов. За редким исключением, более длинные, отрицательно заряженные пептиды элюируются в меньшем объеме по сравнению с короткими, положительно заряженными пептидами. Пептиды, содержащие более шести аминокислотных остатков и несущие слабый отрицательный заряд (—2), элюируются при рН<4,7 короткие пептиды, включающие менее семи остатков и в целом заряженные положительно, элюируются при рн > 4,7. В работах [38, 39] отмечено также удерживание фосфоцеллюлозой гистидинсодержащих пептидов. [c.412]

На SE-сефадекс С-25 фракционировали также триптические пептиды ингибитора Кезела из поджелудочной железы свиньи [42]. SE-сефадекс С-25 уравновешивали 0,05 М аммонийнофор-миатным буферным раствором с pH 4 элюирование вели в ступенчатом или плавном градиенте на фоне 0,05 М раствора ацетата аммония (pH 7,0). [c.415]

Выделение пептидов с остатками цистеина на ртутьсодержащих адсорбентах осуществляется благодаря образованию ковалентных связей и на этом основании может рассматриваться как первый пример ковалентной хроматографии. В ряде работ было описано получение ртутьпроизводных сефарозы [51, 52], целлюлозы [53], сефадексов [54] и сополимера малеиновой кислоты с этиленом [55]. На последнем адсорбенте были выделены SH-пептиды из пептического гидролизата восстановленного инсулина [56]. После элюирования меркаптоэтанолом SH-группы карбоксиметилировали и смесь пептидов разделяли обычными методами. [c.417]

Сильнокислотные полистирольные катиониты в Н+-форме оказывают очень избирательное действие на алифатические сульфоксиды, вероятно, вследствие образования водородных связей между функциональными группами ионита и сульфок-сида. Ароматические сульфоксиды не сорбируются, и поэтому их можно отделить от алифатических. Это явление используют при выделении и очистке алифатических сульфоксидов на смоле дауэкс 50. Сульфоксиды сорбируются из бензольных растворов, а для элюирования наиболее подходящим растворителем является этанол [13]. На одном и том же катионите можно количественно выделять диметилсульфоксид из смеси, содержащей аминокислоты, пептиды и другие соединения [14]. Сульфоксиды, образующиеся при окислении воздухом нефтяных фракций, можно отделить от других более сильных оснований на катионите дуолит С-10 (Duolite С-10). Слабые основания элюируют н-пентаном, бензолом и метанолом, более сильные основания — 10%-ным изопропиламином в метаноле. Методом газовой хроматографии установлено, что метанольная фракция содержит главным образом сульфоксиды [15]. Для разделения меркаптанов и сульфидов можно использовать обмен лигандов [16]. Меркаптаны и диалкилсульфиды сильно сорбируются на крупнопористом катионите амберлист 15 (Ag+ или Си +) (Amberlyst 15) из растворов в толуоле, метаноле или н-гексане, в то время как их адсорбция на анионите амберлист А-27 (0Н ) (Ат- [c.154]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология