Белки проникающая хроматография

В силикагелях—материалах, доступных как образцу, так и противоиону, быстро устанавливается массопередача, что приводит к высокой эффективности колонки. Силикагели с привитыми группами делятся на микро- и макропористые в зависимости от диаметра внутренних пор. Микропористые материалы, имеющие небольшие по диаметру поры, позволяют молекулам растворителя, например воды, а также небольших ионов проникать в полимерную матрицу и задерживают большие молекулы. Большинство полимерных ионообменных силикагелей имеют микроструктуру. Полимерные смолы макропористого типа зачастую используют в жидкостной хроматографии низкого давления. Макропористые силикагели с привитыми ионообменными группами стали применять при разделении больших молекул, например белков. Однако устойчивость сорбента невелика из-за растворения его в водной подвижной фазе. Информация об ионообменниках привитых к силикагелю содержится в приложении 1.3. [c.111]

Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, щироко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек-страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку. Разделение веществ этим методом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой [c.30]

Эккере [33] применил этот принцип к гель-хроматографии и предложил для очень пористых гелей механизм ограниченной диффузии. (В отличие от других типов геля для сефадекса 0-200 коэффициент распределения между фазой геля и элюентом в равновесном состоянии значительно отличался от значения Кв., определенного на колонке.) Согласно новому принципу, объемы выхода макромолекул (белков) с гранулированного геля агара или сефадекса 0-200 определяются скоростью их диффузии в фазу геля. Вследствие медленной диффузии крупные молекулы проникают в гель не столь глубоко, как мелкие, н поэтому вымываются с колонки гораздо раньше. Вновь применив уравнение Ренкина [32], Эккере связал величину /(( , характеризующую поведение макромолекул в геле, с величиной г Я, где г — радиус частиц белка [c.120]

Метод основан на применении ионообменных полимеров. Они состоят из нерастворимого высокополимерного каркаса и связанных с ним групп, способных к ионизации, — ионогенных групп. Цепочки молекул, входящих в состав каркаса, сшиты друг с другом естественными или искусственными мостиками. Частота сшивки влияет на способность полимера к набуханию и на возможность проникновения различных ионов в глубь частицы полимера. В отличие от сефадексов большинство ионообменных полимеров, применяемых для хроматографии (смолы типа Дауэкс ), имеют столь частую сшивку, что молекулы белков не проникают внутрь частицы и взаимодействуют лишь с ее поверхностью. [c.26]

Гель-хроматография — простой, но чрезвычайно эффективный метод, позволяющий определять размеры молекул, а также фракционировать молекулы на основе различий в размерах. Молекула, которая не может проникать в поры молекулярного сита, движется быстрее вдоль колонки, чем молекула меньших размеров. Еще одним чрезвычайно полезным инструментом, применяемым для очистки и качественного анализа смесей макромолекул, служит электрофорез. Довольно трудно получить аналитическое выражение, связывающее наблюдаемую в опыте электрофоретическую подвижность с зарядом и формой молекулы. Однако в некоторых специальных случаях электрофорез лает количественную информацию. Пользуясь методом изоэлектрического фокусирования, находят pH изоэлектрических точек белков. А воспользовавшись электрофорезом в носителе, представляющем собой молекулярное сито, можно крайне просто определять молекулярную массу белков (в присутствии ДСН) или нуклеиновых кислот. [c.306]

Для того, чтобы стал возможен прямой ввод в хроматографическую колонку сложных проб, содержащих резко различающиеся по молекулярным массам компоненты, внешняя поверхность сорбента должна быть инертна по отношению к крупным молекулам в пробе. Однако определение лекарственных препаратов, как правило, выполняется на гидрофобных сорбентах, на которых белковые молекулы необратимо сорбируются и денатурируются, забивая поверхность и пространство между частицами сорбента. Давление на входе в колонку растет, и ее дальнейшая эксплуатация становится практически невозможной. В то же время для белков инертна гидрофильная поверхность, покрытая, например, гидроксильными или аминогруппами. Поэтому нужно, чтобы сорбент, предназначенный для определения лекарственных препаратов при прямом вводе биологических жидкостей в хроматографическую колонку, имел на внешней поверхности гидрофильное покрытие, а внутри пор содержал покрытие из гидрофобных групп. При этом крупные молекулы не должны проникать в поры, т.е. диаметр пор должен быть меньше, чем гидродинамический диаметр крупных молекул. В этом случае будет действовать эксклюзионный эффект для крупных молекул, и они будут выходить из колонки практически без разделения за время, меньшее мертвого времени колонки для молекул, проникающих в поры, будут действовать обычные механизмы адсорбционной, распределительной или ионообменной хроматографии. [c.529]

Гель-хроматография применяется, как уже указывалось, при обессиливании растворов (малые по размеру ионы солей проникаю в поры ге я и удерживаются там), для группового разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных органических соединений (например, глицериде в жирных кислот с молекулярной массой около 200—500), в анализе биологических объектов (часто с использованием буферных систем с целью предотвратить разрушение ферментоп), для определения молекулярной массы белков (в том числе содержащихся в сыворотке К]ювп, в спинн( -мозговой жидкости), углеводородов и др)гих вещеста. [c.285]

Разновидность хроматографического метода, в котором роль неподвижной фазы играет макропористый сорбент, адсорбционно инертный по отношению к молекулам хроматографируемого веш,е-ства, называется гель-проникаюш ей хроматографией, если размеры пор соизмеримы с размерами молекул. Название метода сложилось исторически и недостаточно полно отражает его сущность. Это объясняется тем, что на первых порах (60-е годы) в качестве сорбента использовали только набухающие гели — декстрановые для разделения белков и нолистирольные для анализа полимеров [1, 2]. Они представляют собой трехмерные полимерные сетчатые структуры (рис. HI.1), внутрь которых могут с определенной вероятностью проникать различные макромолекулы. Эта вероятность зависит от соотношения размеров макромолекул и ячеек сетки, а скорость проникновения в гель определяется диффузионной подвижностью макромолекул. Для малых макромолекул она выше, чем для больших. Очень большие молекулы не проникают внутрь геля, а очень малые попадают туда с вероятностью, близкой к единице. [c.81]

В связи с этим можно говорить о необычайно широком проник-иовении хроматографии во все области знания, исследований и промышленности. Это во многом обусловлено необычайной гибкостью и универсальностью. хроматографии, позволяющей иметь дело как с самыми простыми молекулами, так и с молекулами необычайно сложного состава н строения, включая молекуль полимеров и белков. [c.6]

Использование растворов солей для элюирования выделяемых веществ с сорбентов в гидрофобной хроматографии рассмотрено в разд. 7.1. йеннисен и Хейлмейер [20] показали, что элюирующая способность анионов соответствует их расположению в ряду Гофмейстера и элюирующая способность катионов обратна их высаливающему или всаливающему действию. Соли способны проникать непосредственно между белком и гидрофобной поверхностью сорбента, что приводит к десорбции белка. Если за адсорбцию ответ-ствеппы ионные взаимодействия, то элюирование белков должно зависеть от ионной силы раствора, но не от природы и типов используемых солей. Общие аспекты гидрофобной хроматографии, включая реагенты, применяемые для элюирования, были рассмотрены Хьертеном [18]. [c.272]

В настоящее время в ионообменной хроматографии белков и ферментов применяются почти исключительно эти производные. Недавно для тех же целей были синтезированы ионообменные производные агарозы (см. табл. 5.6). Структура матриц этих ионов такова, что в нее легко проникают даже крупные макромолекулы, благодаря чему в ионном обмене участвуют группы, расположенные внутри зерен ионита. Теоретические основы хроматографии белков на ионитах рассматриваются Ти-зелиусом ([211]. В ряде статей и монографий (некоторые из них указаны в табл. 5.13) описаны методы сорбции на ионитах и методы хроматографии белков. В большинстве случаев для хроматографии белков применяют DEAE-целлюлозу. После по- [c.316]

Теория и методология гель-хроматографии подробно обсуждается в ряде обзоров и книг Г1—9]. Этот метод позволяет разделять белки в соответствии с размерами их молекул. Первыми с колонки элюнруются самые большие молекулы, в то время как молекулы меньшего размера, способные диффундировать в поры матрицы, заполненные жидкой фазой, удерживаются на колонке. Размер пор матрицы геля определяет диапазон молекулярных масс макромолекул, способных проникать в частицы геля и выходить из них. Для фракционирования белков пригодны различные полиакриламидные, агарозные и декстрановые гели. [c.106]

Принципы гель-проникающей хроматографии при высоких давлениях (ГПХВД) ие отличаются от принципов классической гель-проиикающей хроматографии (ГПХ). В обоих случаях разделения достигают, пропуская смесь белков через гель с порами определенных однородных размеров. Белки, молекулы которых больше диаметра пор, проходят через колонку, не проникая в гель, и элюируются первыми ( исключенный объем), тогда как белковые молекулы меньшей величины входят в поры, проделывая в результате более длинный путь, н элюируются в соответствии со своими размерами. Небольшие молекулы способны входить во Все поры и поэтому элюируются позже всех ( включенный объем). [c.103]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология