Получение миозина

Принцип постановки эксперимента описан в разделе Получение миозина и определение его АТФазной активности . [c.402]

Работа 148. Получение миозина [c.239]

Ход работы. Мышцы только что убитого животного тщательно измельчить, охлаждая льдом. 100 г измельченной мышцы экстрагировать 300 мл 0,15 М фосфатного буфера с pH 6,5 содержащего хлористый калий в 0,3 М концентрации. Экстрагирование вести при перемешивании при 1°С в течение 10 мин. Смесь развести добавлением 1000 мл воды комнатной температуры, сразу профильтровать и отжать через марлю. Фильтрат перемешать мешалкой до тех пор, пока не произойдет выпадение осадка актомиозина (один-два часа). Выпавший осадок удалить центрифугированием, после чего к опалесцирующей жидкости при постоянном перемешивании в течение 10 мин добавить 1500 мл воды, охлажденной до 0°С. После двухчасового стояния при 0°С часть жидкости слить декантацией и затем осадок миозина отделить центрифугированием. Исследовать растворимость полученного миозина и определить его>изоэлектрическую точку (см. работу 94). [c.239]

Трехмерная структура субфрагмента 1. Необходимым условием для расшифровки трехмерной структуры белка является наличие высококачественных монокристаллов, пригодных для проведения рентгеноструктурного анализа. Методики получения миозина и его фрагментов известны уже более 30 лет и хорошо разработаны, однако, все попытки кристаллизации длительное время оставались [c.253]

Сокращение мышцы происходит в результате взаимодействия белковых молекул. Изображение структурной единицы мышечного волокна (саркомера), полученное методом электронной микроскопии, приведено на рис. 15.8. В центре каждого саркомера находится набор филаментов (нитей) белка миозина-, диаметр филамента примерно [c.436]

ПОЛУЧЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФРАГМЕНТОВ МИОЗИНА. [c.391]

Получение препарата миозина [c.392]

Осаждение миозина. Полученный центрифугат разводят бидистиллированной водой до конечной концентрации КС 0,025—0,03 М, оставляют на 1 ч на льду и центрифугируют 20 мин при 2500 об/мин (можно оставить раствор миозина на ночь и перед центрифугированием декантировать жидкость над осадком). Осадок миозина переносят стеклянной палочкой в мерную пробирку и растворяют его добавлением сухого КС1 до конечной концентрации 0,5 М. [c.393]

Определение активности полученного препарата миозина [c.393]

Метод получения тяжелого меромиозина (ТММ) основан на частичном протеолитическом расщеплении миозина под действием трипсина. Отделение тяжелого меромиозина от миозина и от фрагмента хвостовой части миозиновой молекулы (легкого меромиозина) основано на его хорошей растворимости при низкой ионной силе, когда легкий меромиозин и миозин выпадают в осадок. Для последующей очистки полученного препарата можно воспользоваться колоночной хроматографией или высаливанием сернокислым аммонием. [c.394]

Переваривание миозина и получение раствора тяжелого меромиозина. Тяжелый меромиозин получают перевариванием миозина трипсином при комнатной температуре. К раствору миозина добавляют имидазольный буфер, приготовленный на 0,5 М КС (pH 7,6), до конечной концентрации имидазола 10 мМ и белка 30—40 мг/мл (можно меньше). Раствор трипсина в 0,5 М K I добавляют к раствору миозина, соблюдая весовое соотношение трипсин — миозин 1 100. Через 30—40 мин протеолиз останавливают добавлением раствора ингибитора трипсина из соевых бобов в двукратном избытке по сравнению с весовым количеством трипсина 3. Трипсиновый гидролизат диализуют в течение ночи [c.394]

Толстые нити (толстые миофиламенты) в саркомере надо понимать как образование, полученное путем соединения большого числа определенным образом ориентированных в пространстве молекул миозина (рис. 20.4). [c.649]

Оформление работы. Полученные значения времени истечения для растворов миозина в первом и втором, случаях заносят в таблицу, сравнивают и делают выводы. [c.41]

В 1955 году, измеряя скорость гидролиза АТР миозином, Шноль наблюдал странное распределение результатов — они группировались вокруг 2-х или 3-х дискретных значений, а вероятность появления результатов между ними была ниже. После тщательного воспроизведения результатов, Шноль опубликовал свою первую статью, описывающую эффект микроскопических флуктуаций в журнале Вопросы медицинской химии [91]. Многие журналы с более высокой репутацией его статью отклонили. После неудачных попыток объяснить полученные данные особыми свойствами молекул белков в водных растворах, Шноль начал беспрецедентную 40-летнюю серию аналогичных экспериментов от химических реакций низкомолекулярных соединений до процессов радиоактивности и измерения гравитационной постоянной (последние результаты см. в [92]). [c.122]

Миозин может быть получен при определенных условиях не только в виде золя или геля, но, по Сент-Дьердьи, также в кристаллической форме. По данным М. Н. Любимовой, эти кристаллы являются, однако, волоконцами, состоящими из закрученных пленок миозина. [c.417]

Первоначальное определение молекулярного веса радиационным методом дало величины, хорошо согласующиеся с принятыми значениями (для рибонуклеазы и миозина [L18]). Перечень результатов, полученных этим методом, дан в табл. 62. Если учесть трудности, то согласие с существующими результатами получается очень хорошее. Более того, если имеются расхождения, то это вовсе не должно означать, что радиационный метод неизбежно неправилен. Тщательное обсуждение любых расхождений, вероятно, сможет представить новые сведения относительно поведения молекул в различных условиях облучения. [c.298]

НИИ полученного экстракта до pH 4,6 осаждаются белки осадок растворяют при pH 7 Т. высаливают из раствора добавлением сульфата аммония (до концентрации 40%). В фибриллах мышц различных моллюсков был обнаружен белок, названный н а р а-миозином, к-рый идентичен Т. Биологич. значение Т. определяется его участием в процессе мышечного сокращения, механизм к-рого пока не выяснен. [c.147]

Множество работ посвящено электрофоретическому изучению белковых смесей, экстрагированных из мышц, печени, мозга, поджелудочной железы, бактериальных клеток, а также содержащихся в спинномозговой жидкости, моче, желудочном соке, молоке и т. д. Как правило, при этом приходится предварительно концентрировать раствор. Все эти смеси изучены менее подробно, чем сыворотка крови они обычно более сложны, а на их состав и свойства влияют способы экстракции и концентрирования. Тем не менее полученные результаты имеют большое теоретическое и прикладное значение. Анализ содержания и состава белков в моче помогает установить диагноз при ряде заболеваний, в том числе заболеваний почек и злокачественных новообразованиях. Состав лимфы напоминает состав сыворотки крови изучался обмен белков между этими жидкостями. В экстрактах из мышц изучены электрофоретические свойства актина и миозина, а также ряда гликолитических ферментов. Это перечисление можно, [c.103]

В многочисленных работах, посвященных исследованию величины и ориентации двойного лучепреломления в растворах белковых полимеров, полученные данные, как правило, обсуждаются с использованием модели жестких палочкообразных частиц, что во многих случаях (фиброин щелка [124], пектин [125, 126] и др.) приводит не только к качественному, но и количественному согласию с теорией. В то же время метод двойного лучепреломления оказывается полезным при изучении агрегации частиц и гелеобразования, например, в растворах фибриногена [127] и казеина [128], а также с успехом может применяться для исследования процессов гидролиза (в растворах пектина [129]) и влияния других воздействий на морфологические свойства частиц (миозин [130]). [c.612]

Получение миозина из мышц чрезвычайно осложняется взаимодействием его с актином и аденозинтрифосфатом, а также с различными ионами [57]. Тем не менее можно получить, по-видимому, удовлетворительный препарат с помощью быстрого экстрагирования размельченной мышцы раствором КС1 и последующего- разбавления экстракта, в результате чего концентрация соли понижается настолько, что становится возможным осаждение миозина. Меры предосторожности, которые необходимо принимать при очистке и обращении с этим чувствительным и реак-циониоопосабным материалом, были уже детально описаны [57, 229, 230]. [c.53]

Да). Молекула миозина сильно вытянута в длину, причем ее длинная, стержневая часть образована двумя тяжелыми полипептид-ными цепями, которые на этом участке имеют структуру а-спирали и к тому же закручены одна вокруг другой в суперспираль. N-концы тяжелых цепей образуют глобулярные головки , каждая из которых находится в комплексе с двумя легкими цепями. АТФазная активность миозина сосредоточена в головках , имеющих каждая по одному активному центру. В результате ограниченного протеолиза можно получить два типа протеолитических фрагментов, обладающих в полной мере АТФазной активностью так называемый тяжелый меромиозин с м. м. 350 ООО Да, лишенный большей части стержня, или хвоста , миозино-вой молекулы, а также препараты головок . Электрофоретическая картина зависит от вида примененной протеазы, ее концентрации и времени обработки белка. Головки , или, как их называют, субфрагмент-1, полученный путем химиотрипсинового протеолиза, при ДСН-элект-рофорезе дают полосу 96 ООО Да — фрагмент тяжелой цепи, и две полосы легких цепей — примерно 18 000 и 15 000 Да. Две другие легкие цепи отсутствуют вследствие деградации. Тяжелый меромиозин обычно дает целый набор полос, среди которых присутствуют 81 ООО Да, 74 ООО, [c.392]

В 20-40-е гг. получили развитие физ.-хим. методы анализа Б. Седиментациоиными и диффузионными методами были определены мол. массы многих Б., получены данные о сферич. форме молекул глобулярных Б. (Т. Сведберг, 1926), выполнены первые рентгеноструктурные анализы аминокислот и пептидов (Дж. Д. Бернал, 1931), разработаны хроматографич. методы анализа (А. Мартин, Р. Синг, 1944). Существенно расширились представления о функциональной роли Б. был выделен первый белковый гормон-инсулин (Ф. Бантинг, Ч. Г. Бест, i922 антитела были идентифицированы как фракция у-глобулинов (1939) и тем самым обнаружена новая ф-ция Б.-защитная. Важным этапом явилось открытие ферментативной ф-ции мышечного миозина (В.А. Энгельгардт, М. Н. Любимова, 1939) и получение первьк кристаллич. ферментов (уреазы-Дж. Б. Самнер, 1926 пепсина-Дж.X. Нортроп, 1929 лизоцима-Э. П. Абрахам, Р. Робинсон, 1937). [c.248]

Актомиозин образуется при соединении миозина с F-актином. Актомиозин, как естественный, так и искусственный, т.е. полученный путем соединения in vitro высокоочищенных препаратов миозина и Р-актина, обладает АТФазной активностью, которая отличается от таковой миозина, АТФазная активность миозина значительно возрастает в присутствии стехиометрических количеств Р-актина. Фермент актомиозин активируется ионами Mg и ингибируется этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) и высокой концентрацией АТФ, тогда как миозиновая АТФаза ингибируется ионами Mg , активируется ЭДТА и не ингибируется высокой концентрацией АТФ. Оптимальные значения pH для обоих ферментов также различны. [c.650]

Венгерский ученый Штрауб нашел, что в зависимости от продолжительности экстракции миозин может быть получен в двух формах. При кратковременной экстракции получается миозин А, при длительной — очень вязкий миозин Б. Штрауб установил, что превращение миозина А в миозин Б обусловлено вторым белком, переходящим в раствор при длительной экстракции, и назвал этот белок актином. Актин и миозин, соединяясь, образуют комплекс — актомиозин, обладающий высокой вязкостью- [c.248]

Получение солевой вытяжки (миозин).. Ткань, оставшуюся после получения водной вытяжки, отмывают от следов водорастворимой альбуминовой фракции путем повторного экстрагирования новыми порциями воды до, тех пор, пока промывная жидкость не перестанет давать биуретовую реакцию. Промывные жидкости выбрасывают. Отмытую ткань заливают в ступке 3 мл 5% раствора. хлористого калия и растирают пестиком в течение 5 минут. В раствор переходит глобулиновая фракция белков мышечной тка-. ни. Жидкость отделяют фильтрованием, остаток ткани сохраняют для получения коллагена, а с небольшими порциями фильтрата проделывают биуретовую реакцию, ре--акцию вьцсалива ния глобулинов и осаждение белка путем разведения десятикратным объемом дистиллированной воды. [c.249]

Астбэри и Дикинсону (Astbury, Di kinson, 1940) удалось показать, что миозин (фибриллярный белок мышц) также вызывает диффракцию рентгеновых лучей, будучи приготовлен в виде ориентированной пленки. Полученная при этом картина во многих отношениях подобна наблюдаемой у кератина шерсти названные авторы предположили, что полипептидная цепь миозина свернута так же, как у кератина. Инфракрасный дихроизм у миозина также подобен обнаруживаемому у свернутых синтетических полипептидов и а-кератина. [c.318]

Актин, открытый Штраубом в 1942 г., экстрагируется водой из мышц после извлечения из них миозина 0,6 М раствором КС1 и последующей обработки ацетоном. Этот белок может существовать в двух формах, резко отличающихся гю своим физико-химическим свойствам — глобулярной (Г-актин) и фибриллярной (Ф-актин), тонкое строение которых хорошо видно на электронных микрофотографиях, полученных с помощью электронного микроскопа (см. рис. 4, стр. 17). Считается, что фибриллы полимеризованного актина получаются не путем развертывания (разматывания) глобул Г-актина, а в результате их ассоциации в длинные цепочки. [c.417]

Оставшееся на фильтре мясо промывают 2—3 раза водой и хорошо отжимают промывные воды отбрасывают. Побелевшие мышечные волокна переносят в стакан и заливают 15%-ным водным раствором хлорида аммония (60—70 мл). Смесь оставляют на 30—10 мин, часто перемешивая ее палочкой, и затем переносят в воронку на сухой складчатый фильтр. Фильтрование происходит медленно. Полученный раствор глобулина мяса—миозина—применяют для опытов при разбавлении водой он мутнеет и из него выделяется осадок миозииа. [c.313]

Как видно из рис. 17, абсорбционные кривые синтетических гликогенов очень близки природным и сильно отличаются от кривых иод-ами-лопектина. Синтетические гликогены, подобно природным, давали комплекс с миозином, что проявлялось в характерном сдвиге максимума поглощения в коротковолновую часть спектра (2660 А). Это указывает, что полученные синтетич кие гликогены близки к природным, мышечным. Однако некоторые синтетические полисахариды являлись как бы промежуточными между гликогенами и амилопектинами. Впоследствии близкие им соединения были найдены в природе (см.с. 136). [c.119]

Электрофорез производился на установке, изображенной на рис. 20. Тонкослойная пластинка помещалась на охлаждаемый столик, который также использовался в качестве подставки при проточной хроматографии. Электрофоретическое разделение производили при напряжении 950—1000 в и силе тока 30 ма. Для получения пептидной карты на пластинку размером 20 x 20 см наносили 0,5—0,05 мг пептидной смеси. Авторы работы [40] указывают, что за день можно приготовить 8 пептидных карт. На рис. 21 представлена пептидная карта триптического гидролизата миозина. Детектирование пептидных пятен производилось с помощью нингидринового или хлортолидинового реактивов. Весьма перспективно детектирование пептидов на пластинке с помощью реакции динитрофенилирования в модификации Патаки [41] [c.318]

При длительнохм экстрагировании мышцы раствором Вебера в раствор переходит миозиноподобный белок, обладающий гораздо большей вязкостью, чем миозин, получаемый при кратковременном экстрагироваппи [99], Этот белок оказался сложным соединением, состоящим из миозина и второго белка, названного актином. Для получения актина мышца сначала экстрагируется в течение короткого времени водой, а затем ацетоном, после чего [c.187]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология