ГХ-анализ белковых и пептидных гидролизатов

Все белки, изученные до сих пор, обладают антигенными св-вами. У белков различают линейные детерминанты, построенные из аминокислотных остатков, расположенных рядом в одном участке полипептидной цепи, и конформационные, к-рые слагаются из аминокислотных остатков разных участков одной или большего числа полипептидных цепей. Антитела, полученные при иммунизации данного животного определенным белком, могут реагировать, хотя и с небольшим сродством, с нек-рыми пептидами, выделенными из гидролизата зтого белка. Такие пептиды, построенные из 5-7 остатков, часто располагаются на изгибах или выступающих отрезках пептидной цепи и, очевидно, являются детерминантами или их частями. Однако в иных условиях, напр, при иммунизации др. вида животного, могут образовываться антитела к иным участкам молекулы того же белкового А. Практически вся пов-сть белковых молекул обладает антигенными св-вами, она, т. обр., представляет собой сумму перекрывающихся детерминант, каждая из к-рых может вызывать иммунную р-цию или не вызывать ее в конкретных условиях. Последние определяются различиями в строении между белковым А, и собственными белками организма, а также регуляторными иммунными механизмами, находящимися под генетич. контролем. По-видимому, почти все детерминанты белков конформационно зависимы. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, антигенные детерминанты обладают повыш. подвижностью. [c.174]

Аминокислотный анализ существенно способствовал бурному развитию химин белка. Главными областями применения аминокислотного анализа (наряду с идентификацией отдельных аминокислот) являются установление аминокислотного состава белковых гидролизатов, определение первичной структуры белков, а также аналитический контроль пептидного синтеза. [c.55]

Анализ ферментативных гидролизатов белков. В 1957 г. Ингрэм [61 впервые показал, что двухэтапным разделением с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге можно анализировать сложные пептидные смеси, ферментативные гидролизаты и т. п. Такой анализ выявляет самые незначительные различия, с которыми можно встретиться, например, при изучении видовой специфичности или в других сравнительных исследованиях. Метод отпечатков пальцев можно назвать одним из важнейших методов современной биохимии, молекулярной биологии и иммунохимии, так как он позволяет выделить в чистом виде определенный пептид или провести микропрепаративное разделение сложной смеси. [c.103]

Анализ аминокислотного состава включает полный кислотный гидролиз исследуемого белка или пептида с помощью 5,7 н. соляной кислоты и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Гидролиз образца проводится в запаянных ампулах в вакууме при ПО "С в течение 24 ч. При этом полностью разрушается триптофан и частично серии, треонин, цистин и цистеин. а глутамин и аспарагин превращаются соответственно в глутаминовую и аспарагиновую кислоты. В то же время пептидные связи, образованные аминокислотными остатками с разветвленной боковой цепью (Val, Не. Leu), из-за стерических препятствий гидролизуются частично. Особенно стабильны связи Val—Val. Ile—Ile, Val—De и Ile—Val. [c.34]

В этом заключается так называемый метод отпечатков пальцев , а полученные при анализе гидролизатов белка результаты называют пептидными картами [5]. [c.134]

Пептидная связь в белках способна гидролизоваться под влиянием большого числа реагентов, к которым относятся растворы кислот и щелочей (источников водородных и гидроксильных ионов), твердые ионообменные смолы, водорастворимая полистиролсульфокислота и протеолитические ферменты. Такие ферменты, как пепсин и трипсин, могут вызывать существенное расщепление белков в относительно мягких условиях температуры и pH. Однако большинство ферментов непригодно для приготовления полных гидролизатов белков при проведении аминокислотного анализа, так как они проявляют заметную специфичность в отношении легкости гидролиза различных пептидных связей в зависимости от окружения этих связей в полипептидной цепи. Дополнительную трудность представляет предотвращение побочных реакций. [c.122]

Прежде чем определять аминокислотную последовательность белка, необходимо установить его аминокислотный состав. При этом можно использовать различные методы (разд. 4.1.3.3 и след.). Наиболее широко применяемый в настоящее время количественный метод аминокислотного анализа белкового гидролизата основан на использовании ионообменной хроматографии (разд. 5.6.3.3 и след.). Белок обычно гидролизуют в 6 н. НС1 при 100°С в течение 20 и более часов в отсутствие воздуха. Как правило, проводят несколько параллельных опытов с различной продолжительностью гидролиза при этом удается оценить скорость разрушения лабильных аминокислот, таких, как серии, треонин и тирозин, а также добиться полноты гидролиза наиболее стабильных пептидных связей, особенно образованных остатками изолейцина и валина. При кислотном гидролизе разрушается триптофан его можно опреде- [c.166]

Существует значительный разрыв между числом статей, описывающих газохроматографические методы, и числом работ, посвященных приложению этих методов. Качественные анализы или же анализы, ограничивающиеся измерением лишь нескольких аминокислот пептидных или белковых гидролизатов . были выполнены уже давно [25, 69, 88, 147]. Наиболее полными являются данные Герке проведенное им газохроматографическое определение аминокислот в гидролизатах бычьего сывороточного альбумина, каппа казеина, белка бобов [41] и рибонукле-азы [43] прекрасно согласуется с результатами, полученными на ионообменниках. В табл. 5, 6 и 7 приведены некоторые экспериментальные данные, полученные ГХ н-пропиловых эфиров ацетиламинокислот из нескольких пептидных гидролизатов. Для гидролизатов фибриноиептидов те же молярные соотношения (табл. 6) найдены на ионообменниках [62]. С помощью ГХ контролировался синтез брадикинина (табл. 7). [c.130]

Если один из сравниваемых белков обладает какими-то отличиями в аминокислотной последовательности определенного участка первичной цепи, то пептидные фрагменты этого участка будут передвигаться по электрохроматографическому полю с иными скоростями (а часто и в ином направлении) по сравнению с фрагментами такого же участка другого белка. В результате первые пептиды займут особое положение на пептидных картах, тогда как фрагменты цз идентичных участков полипептидных цепей займут аналогичные места. Отличия в последовательности, таким образом, будут обнаружены в пятнах, имеющихся на одной электрохроматограмме и не появляющихся на другой. Элюция и количественный аминокислотный анализ лишних пептидных пятен позволяет далее установить наличие специфических для данного белка аминокислот, характеризующих эти фрагменты. В частности, методом пептидных карт для триптического гидролизата удалось выявить особенности структуры различных гемоглобинов. Гемоглобин 5 отличается от нормального гемоглобина А по электрофоретической подвижности и частично замещает последний у больных серповидно-клеточной анемией. Исследования методом пептидных карт позволили локализовать различие в первичной структуре между гемоглобинами А и 5 в одной точке полипептидной цепи [c.82]

N-Koнцe вoй лизин дает а,е- бис-динитрофенильиое производное лизин, расположенный в середине цепи или на С-конце, дает е-моноди-нитрофенильное производное. Фенольная группа тирозина и имино-группа гистидина также реагируют с динитрофторбензолом, но образующиеся производные расщепляются в условиях кислотного гидролиза пептидной связи. Для определения последовательности аминокислот белок подвергают частичному гидролизу и определяют строение образовавшихся ди- и трипептидов анализом концевых групп. Если в гидролизате охарактеризованы все возможные дипептиды, то последовательность аминокислот в белке может быть однозначно определена без дальнейшего анализа концевых групп. [c.690]

Ряд авторов с успехом использовали хроматографию в тонком слое для анализа ферментативных гидролизатов белков 13, 7, 16, 17]. Двумерной хроматографией можно получить пептидные карты в системах хлороформ — метанол — 25%-ный ЫН40Н (2 2 1) и пиридин — уксусная кислота — бутанол — вода (40 14 68 25) (двукратная хроматография). [c.237]

Для установления количественного состава входящих в гликопротеин моносахаридов и аминокислот биополимер подвергают полному кислотному гидролизу, и состав гидролизата определяют обычными методами количественного анализа. Пептидные связи устойчивее гликозидных по отношению к кислотам, поэтому для полного расщепления на мономеры гликопротеины приходится гидролизовать в более жестких условиях, чем обычные полисахариды (6 н. НС1, 100—ПО °С, 24 ч) . Нужно иметь в виду, что как сахара, так и аминокислоты могут частично распадаться в условиях кислотного гидролиза, причем в ряде случаев можно с помощью ХОЛОСТЫХ опытов внести соответствующие поправки при анализе. Специфической для гликопептидов побочной реакцией в условиях кислотного гидролиза является возможная конденсация сахаров с аминокислотами, приводящая к окрашенной сложной смеси различных веществ, в том числе простейших карбонильных соединений (так называемая реакция Майяоа). Например, по данным Готшалка , потеря аминокислот при кислотном гидролизе богатых сахарами гликопротеинов может составлять до 30 %. Количественное определение моносахаридов проводят с использованием хроматографии, спектрофотометрической и колориметрической техники (см. гл. 14). Для анализа аминокислот применяют обычно методы, хорошо известные из химии белка. Так, количественный анализ аминокислотного состава проводят в автоматических анализаторах или с помощью газо-жидкостной хроматографии . [c.567]

Анализ этого типа состоит в параллельном ферментативном расщеплении сравниваемых белков и сопоставлении их электрохроматограмм. Для этого на угол большого листа хроматографической бумаги типа ватман № 3 наносится образец гидролизата, который затем подвергают электрофорезу при напряжении около 1,5—3 кв в пиридин-ацетатных или ацетат-формиатных буферных растворах. При этом исходная смесь разделяется на ряд фракций на основании различия электрохимических свойств соответствующих фрагментов белка. Однако полного разделения пептидных осколков электрофорез дать не может. Поэтому по окончании электрофореза лист высушивают и пятна подвергают хроматографическому разделению в перпендикулярном нгдрав-лении с использованием различных систем растворителей. По окончании хроматографии лист высушивают и опрыскивают раствором нингидрина пятна пептидов проявляются при кратковременном нагревании при 70° или при выдерживании листа в темноте в течение 12—24 часов. При соблюдении постоянства всех условий и стандартности материалов картина воспроизведения пептидных карт постоянна, и положения пятен от опыта к опыту совпадают с точностью от 3 до 5 мм. [c.82]

Восстановительное расщепление при действии боргидрида лития носит избирательный характер. В молекуле инсулина расщепление особенно активно протекает по одному из остатков глицина, В некоторых белках лабильны, по-видимому, пептидные связи, образованные остатками глутамина и аспарагина. В табл. 29 приведен перечень остатков дикарбоновых кислот, амидов дикарбоновых кислот и С-концевых остатков, присутствующих в немодифи-цированном белке вместе с перечнем соответствующих продуктов, присутствующих в гидролизате этерифицированного и восстановленного белка. В табл. 30 приведен анализ продуктов, полученных из [c.196]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология