Аминокислотные остатки в нативных белках

Возможности спектроскопии флуоресценции как средства исследования макромолекул в растворе впервые были продемонстрированы при изучении растворов белков [548, 549]. Три из присутствующих в белках аминокислоты флуоресцируют максимум спектра испускания для фенилаланина наблюдается при 282 мц, для тирозина — при 303 м л и для триптофана — при 348 м х, [550]. Спектры испускания простых пептидов весьма напоминают спектры свободных аминокислот, однако в белках они резко изменяются за счет безызлучательного перехода энергии возбуждения между аминокислотными остатками. Известно, что такие процессы чрезвычайно эффективны на расстояниях до 40 А [551]. Вследствие этого перехода энергии флуоресценция фенилаланина может наблюдаться лишь в отсутствие тирозина и триптофана (т. е. в желатине), а флуоресценция тирозина обнаруживается только в отсутствие триптофана (т. е. в инсулине), в то время как большинство белков имеет спектры испускания, приписываемые остаткам триптофана. Эти спектры испускания значительно изменяются для нативных белков, однако они становятся идентичными при денатурации белков в 8 Ai растворе мочевины [549] этот факт указывает на то, что характер спектра и квантовый выход флуоресценции подвержены изменениям, обусловленным как природой среды, окружающей остаток триптофана, так и конформационными превращениями полипептидного хребта, к которому присоединена флуоресцирующая боковая цепь. [c.188]

Для точной локализации активного участка с помощью метода связывания клеток были проверены синтетические пептиды, соответствующие различным участкам сегмента из 108 аминокислотных остатков. Были поставлены эксперименты двух типов. В одних пептиды ковалентно связывались через цистеиновый остаток с белком, покрывающим пластик, после чего их проверяли на способность вызывать прикрепление клеток. Полученные результаты представлены в табл. 14-3. В других опытах пластиковые чашки покрывали нативным фибронектином и клетки инкубировали в чашках в течение 30 мин в присутствии синтетических пептидов, указанных в табл. 14-4. Затем чашки отмывали и подсчитывали число прикрепившихся клеток. [c.270]

В определенных условиях молекулу рибонуклеазы можно расщепить с помощью фермента субтилизина. При этом разрывается связь между 20-м (аланин) и 21-м (серии) остатками и образуется два пептида — короткий (называемый 5-пептидом), содержащий 20 остатков, и более длинный (называемый 5-белком) из 104 остатков. Поскольку первый остаток цистеина находится в молекуле на 26-м месте, отщепление 5-пептида, состоящего из 20 первых аминокислотных остатков, равнозначно отщеплению хвоста фермента. По отдельности ни хвост , ни 5-белок не проявляют ферментативной активности, но их экви-молярная смесь активна. Очевидно, несмотря на разрыв связи между 20-м и 21-м остатками, благодаря взаимодействию боковых цепей образуется активная третичная структура. Если, так же как это делалось в случае нативного фермента, восстановить, а затем вновь окислить 5-белок, то получающийся продукт ничем не отличается от первоначального 5-белка. После добавления к реконструированному 5-белку 8-пептида активность в большой степени восстанавливается. По-видимому, правильное образование дисульфидных связей происходит и в отсутствие 5-пептида. Однако он все же несет какую-то определенную функцию, так как в его присутствии уменьшается количество осадка, состоящего, как предполагают, из молекул, связанных поперечными связями. Если опыт по восстановлению и последующему окислению производится с раствором, содержащим как 5-пептид, так и 5-белок, процент растворимого активного материала оказывается более высоким. [c.280]

Инсулин состоит из 51 аминокислотного остатка, которые составляют две цепи цепь А (21 остаток), цепь В (30 остатков). Обе цепи связаны двумя дисульфидными мостиками. Цепь А содержит третий дисульфидный мостик, замыкающий петлю, состоящую -из шести аминокислотных остатков. Последовательность аминокислот в инсулине определена [78] и проведено его рентгеноструктурное исследование [79]. Цепь А имеет сильно свернутую структуру с короткими квазиспиральными участками. Участки а-опиралей имеются в цепи В между дисульфидными мостиками. Низкая молекулярная масса (5780), казалось бы, делает инсулин привлекательным объектом для исследования с помощью ЯМР, тем не менее еще нет публикаций об изучении этим методом нативного белка. Отчасти, видимо, это объясняется тем, что в нем не выделен активный центр . Гормональная функция инсулина — способность понижать содержание сахара в крови —хорошо известна, но непонятна с химической точки зрения. Инсулин обладает ярко выраженной способностью образовывать полимеры. Димер и гексамер хорошо охарактеризованы [79]. В димере наблюдается интересное окружение (по типу ящика ) остатков Тир-26 (В) и Фен-24 (В), а также остатков во второй входящей в димер молекуле, связанных с двумя первыми осью симметрии второго порядка. Это явление представляет несомненный интерес для изучения на частоте 220 МГц. [c.384]

Поскольку пептидные цепи в нативном белке строго ориентированы, а в денатурированном белке дезориентированы, энтропия денатурированных белков выше, чем энтропия нативных. Разница между величинами энтропии нативного и денатурированного белков получила название энтропии конфигурации [197]. При допущении некоторых упрощений она может быть выражена как отрицательный логарифм вероятности. Этим путем были получены величины от —4,3 до —6,1 единицы энтропии для каждого аминокислотного остатка белка, содержащего от 300 до 30 ООО аминокислот 10—20 различных типов. При этом расчете допускается, что число аминокислот каждого типа в белке одинаково. Если же принять, что число аминокислот различного типа в белке неодинаково, приведенные выше величины энтропии для каждой аминокислоты возрастут до —8 кал град. Для пепсина, молекулярный вес которого сравнительно невысок (35 000), такого рода вычисление дает величину, равную —5 кал1град на каждый аминокислотный остаток, а при Т = 300° — величину, равную 300(—5) =—1 500 кал на аминокислотный остаток [197]. дЯдля денатурации пепсина равна 85 ООО кал моль, или 300 кал для одного аминокислотного остатка. Из этого сопоставления очевидно, что ТЛ8 значительно больше, чем АН, и это означает, что денатурация сопровождается значительным увеличением энтропии. [c.165]

Значение сил, которые стабилизуют третичную структуру рибонуклеазы, иллюстрируется также экспериментами несколько иного рода. Возможен избирательный разрыв пептидной связи, соединяющей аланиль-ный остаток в положении 20 с серильным остатком, находящимся в положении 21. При этом молекула фермента расщепляется па короткую пептидную цепь ( 8-пептид ) и остаточную структуру, содержащую все дисульфидные поперечные связи ( 8-белок ). Обнаружено, что каждый в отдельности компонент является нативным, однако ферментативная активность почти полностью восстанавливается, если смешиваются стехиометрические количества двух компонентов, даже при очень сильном разбавлении [401]. Эти данные согласуются с константой ассоциации 8-пептида с 8-белком, составляющей по меньшей мере 2-10 л1молъ. Эти результаты показывают, что преимущества, свойственные специфическому складыванию нативного фермента, настолько сильно зависят от взаимодействия боковых цепей, соединенных с полипептидным скелетом, что пространственное расположение может быть сохранено после разрыва цепи. Было даже обнаружено, что ферментативная активность в основном сохраняется, если в 8-пептиде изъять семь аминокислотных остатков (с 14 по 20). Отсутствие этого довольно длинного отрезка основной цепи, по-видимому, не вызывает изменений основных особенностей третичной структуры, характерной для нативного белка [402, 403]. [c.139]

Полипептидная цепь в состоянии статистического клубка характеризуется большой гибкостью. Обычно полагают, что аминокислотный остаток в свободном состоянии обладает в среднем десятью приблизительно равновероятными конформациями. В нативной структуре белка у каждого остатка из них реализуется одна конформация, а в статистическом клубке могут попеременно присутствовать все десять. Поэтому у развернутой полипептидной цепи возможно огромное количество изоэнергетических конформаций, состоящих только из самых предпочтительных состояний остатков (приблизительно 10", где п — число остатков в цепи). К. Тэнфорд [23] и П. Флори [24] полагают, что денатурированный белок является правильным статистическим клубком. [c.345]

Рис. 6.11. Схематическое изображение скручивания полипептидной цепи суперок-сиддисмутазы из эритроцитов быка. Белок содержит 151 аминокислотный остаток, одну дисульфидную связь (внутрицепочечную) и по одному атому меди и цинка. Стрелками показано направление полипептидной цепи от N1 2- до СООН-концевого остатка в тех областях, которые участвуют в образовании складчатых листков. Нативный фермент состоит из двух идентичных цепей или субъединиц, каждая из которых обладает показанной иа рисунке конформацией. В глобулярных белках складчатые листки не плоские антипараллельные складчатые листки часто располагаются в форме цилиндра, как, например, в данном случае. (С любезного разрешения Д. Ричардсон.)

В расчете БПТИ учитывались внутримолекулярные ван-дер-ваальсовы электростатические и торсионные взаимодействия, а также водородные связи. Каковы же вклады этих взаимодействий в энергию нативной конформации белка Аминокислотная последовательность БПТИ включает 18 остатков, несущих 12 положительных и 13 отрицательных целочисленных зарядов. Стабилизирующий вклад электростатических взаимодействий заряженных остатков составляет около -50 ккал/моль, а дестабилизирующий - -1-35 ккал/моль. Следовательно, хотя электростатические взаимодействия и понижают конформационную энергию приблизительно на 15 ккал/моль, их интегральный вклад в стабилизацию структуры БПТИ невелик (5%). Суммарный стабилизирующий эффект водородных связей составил около -14 ккал/моль, т.е. < 5%. Обнаруженные в расчете водородные связи обусловлены сложным комплексом многих межостаточных взаимодействий, среди которых собственно водородные связи играют незначительную роль. Общая энергия торсионных взаимодействий в найденной конформации БПТИ равна около -1-58 ккал/моль, те -10 ккал/моль на остаток. Из этого следует, что взаимные расположения практически всех атомных групп основных и боковых цепей аминокислотных остатков отвечают минимумам торсионных потенциалов. Таким образом, доминирующий вклад (75%) в конформационную энергию межостаточных взаимодействий белка вносят ван-дер-ваальсовы, точнее, дисперсионные контакты. [c.468]

Достичь этой цели, т.е. предсказания по аминокислотной последовательности конформационно-жестких и лабильных участков, можно тремя способами. Один из них универсален, а два других, хотя и имеют частный характер, представляют самостоятельный интерес и могут дополнять и контролировать друг друга. Первый способ требует распределения пространственного строения пептидных участков фиксированной длины по определенным таксономическим группам - шейпам, обобщенным структурным элементам цепи, отражающим потенцию соседних остатков к средним взаимодействиям. По ряду причин оптимальными являются пентапептидные участки. Их структурная селекция по шейпам может быть осуществлена с помощью "скользящей рамки" с шагом в один остаток для всех белков, нативные конформации которых известны. Максимально возможное число шейпов у фрагмента из п остатков равно 2" при л = 5 оно составляет 16. Можно надеяться, что систематика белковых пентапептидных участков, количество которых превышает 100 тыс., по 16 группам и последующий анализ каждой группы приведут к установлению корреляций между составом и порядком аминокислот в пентапептидах, с одной стороны, и шейпам основной цепи, с другой. Такие корреляции, очевидно, не будут однозначными, и для большинства пентапептидов приемлемыми окажутся три-четыре, а то и большее число шейпов. Специальные расчеты, однако, показали, что и в этом случае конформационно-жесткие участки смогут обнаружиться по тенденции к снятию энергетического вырождения шейпов фрагментов, перекрывающихся по 1-4 остат- [c.592]

Помимо нолиэлектролитов с гибкими цепными полиионами, которые могут иметь широкий набор конформаций, рассмотрению подлежат заряженные макромолекулы, принимающие специфические конформации, обсужденные в гл. III. Белки имеют разнообразное множество ионогенных групп в боковых цепях аминокислотных остатков, а именно карбоксильные группы глутаминовой и аспарагиновой кислот, имидазольпые группы гистидина, аминогруппы лизина, фенольные группы тирозина, тиольные группы цистеипа и гуанидиновые остатки аргинина. Поэтому в зависимости от состояния ионизации они могут обладать суммарным положительным или отрицательным зарядом. Третичная структура глобулярных белков обычно достаточно устойчива для того, чтобы допустить значительное увеличение суммарного заряда до начала денатурации. Другим полиэлектролитом со специфической конформацией является нативная форма дезоксирибонуклеиновой кислоты. Мы видели, что она существует в растворе в виде двойной спирали, которая ведет себя почти так же, как и жесткая стержневидная частица. В нейтральном растворе вследствие ионизации функциональной группы фосфорной кислоты частица имеет один отрицательный заряд, приходящийся на нуклеотидный остаток. В кислой или щелочной среде в установлении ионизационного равновесия принимают участие пуриновые и пирамидиновые остатки, что, как будет показано ниже, влияет на устойчивость нативной формы ДНК. [c.268]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология