Другие системы растворителей для разделения ДНФ-аминокислот

Небольшие органические молекулы, находящиеся в живых тканях, можно разделить на две большие группы. Одна из них включает водорастворимые вещества, такие, как аминокислоты и сахара, нерастворимые в апротонных растворителях (хлороформе или эфире). Другая группа охватывает жирорастворимые вещества, которые растворяются в хлороформе, эфире или других органических растворителях, но обычно не растворяются в воде. Эти соединения носят общее название липиды. Ясно, что такое грубое разделение, основанное на способности к растворению в определенных типах растворителей, не учитывает общие специфические структурные особенности соединений. Внутри каждой обширной группы веществ можно выделить ряды соединений с общими функциональными группами и характерными структурными особенностями. Низкая растворимость в воде предполагает, что в липидах преобладают неполярные (т. е. углеводородные) фрагменты, а высокополярные группы и группы, обладающие способностью образовывать водородные связи, или вообще отсутствуют, или составляют незначительную часть молекулы. Среди соединений, входящих в класс липидов, встречается немало таких, которые имеют чрезвычайно большое значение для биологии. К ним относятся витамины А и О (разд. 22.2) и стероидные гормоны (разд. 22.2), находящиеся в следовых количествах и все вместе составляющие лишь очень малую часть от общего содержания липидов в любой живой системе. [c.329]

Другие системы растворителей для разделения ДНФ-аминокислот [c.156]

Классификационная теория Киселева дает теоретическое истолкование практическому опыту, накопленному в тонкослойной хроматографии по подбору селективных разделительных систем, и на этой основе позволяет оптимизировать их состав. Ограничимся одним примером, связанным с раздвоением ДНФ-аминокислот, представляющих сложные органические соединения с группировками I, II и III типов. Для их разделения используется система, состоящая из водного аммиака на силикагеле (неподвижная фаза) и смеси пиридина, толуола и этиленхлоргидрина (подвижная фаза). Неподвижную фазу можно отнести к ослабленному II типу (силанольный протонизированный водород, инактивированный водородными связями с водой и аммиаком). Также ясна роль компонентов в подвижной фазе толуол играет роль растворителя пиридин, обладающий неподеленной парой электронов на азоте, конкурирует на силикагеле с ДНФ-аминокислотами, а молекулы этиленхлоргидрина выполняют как бы буферные функции, образуя специфические связи с ДНФ-аминокислотами при переносе их в подвижную фазу и вступая в межмолекулярное взаимодействие друг с другом при переносе ДНФ-аминокислот в неподвижную фазу. Все это создает весьма тонкие эффекты, позволяющие разделять очень близкие вещества. Подобные представления дают возможность сделать два предсказания коэффициент распределения Кр ДНФ-аминокислот будет расти, и, следовательно, Rf уменьшится при повышении содержания аммиака в неподвижной фазе и увеличении концентрации пиридина в подвижной фазе. Эти предсказания соответствуют экспериментальным фактам (см. рис. 6). [c.208]

Принцип распределительной хроматографии основан на различии в коэффициентах распределения аминокислот между водой и органическим растворителем. Особенность метода распределительной хроматографии на бумаге по сравнению с обычной экстракцией ам.инокислот из водного раствора органическим растворителем заключается в том, что одну из фаз, чаще всего водную, помещают на какой-нибудь инертный твердый носитель, а органический растворитель — подвижная фаза,— проходя через первую, извлекает и распределяет аминокислоты на бумаге в соответствии с их коэффициентами распределения. Положение аминокислот на бумаге определяют по отношению скорости движения аминокислоты скорости движения фронта растворителя и обозначают Rf. Величина за висит в первую очередь от строения аминокислоты, затем от системы растворителей, pH среды и сорта бумаги, Чем полярнее аминокислота, тем меньше она растворяется в органических растворителях и тем меньше ее R . Увеличение длины углеродной цепи повышает . Введение в молекулу полярных групп, например, гидроксильной, аминной или карбоксильной понижает Rf Так, Rf фенилаланина в системе фенол/вода = 0,85, а тирозиит 0,51. Другие примеры изменения в зависимости от строения аминокислоты представлены на рис. 3 и 4. Подбирая соответствующие смеси растворителей, можно провести достаточно тонкое разделение аминокислот. Наиболее часто пользуются для такого разделения системами вода — фенол — аммиа вода — бутапол — уксусная кислота бутанол — аммиак — коллидин и т. д. Разделение можно проводить на одномерной или двумерной хроматограммах. Можно пользоваться также различными типами распределительной хроматографии на бумаге — нисходящей, восходящей и радиальной. Величины Rt для каждой из систем растворителей оказываются постоянными при соблюдении [c.479]

Для разделения методом ХТС свободных аминокислот можно непосредственно воспользоваться растворителями, известными из хроматографии на бумаге, тогда как для разделения ДНФ-аминокислот они оказались либо совсем непригодными, либо применимыми весьма ограниченно. Определение ДНФ-аминокислот методом хроматографии на бумаге является весьма сложным процессом, поскольку наблюдается образование хвостов и величины Rf сильно зависят от нанесенного количества вещества и присутствия других ДНФ-аминокислот. Хорошим растворителем в хроматографии на бумаге оказалась толуольная система по Бизерте и Осте [45], м-бутиловый спирт — [c.416]

В пятидесятых годах, в период бурного развития БХ, был опубликован ряд статей с описанием методик и систем растворителей, предназначенных для разделения белковых гидролизатов или аминокислот, полученных из различных физиологических жидкостей (см. [51, 77]). Эти системы использовались для разделения сложных смесей аминокислот и пептидов и смесей аминокислот, с трудом поддающихся идентификации, например лейцин, изолейцин. С появлением автоматических аминокислотных анализаторов [120], а также новых ионообменников (см. гл. 5) БХ все реже и реже используют для анализа аминокислот и пептидов. В настоящее время в лабораториях, ведущих исследование белков, методом БХ проводят главным образом окончательную очистку простых смесей пептидов, полученных с помощью других методов разделения, кроме того, БХ служит одним из критериев однородности вещества (часто в сочетании с электрофорезом на бумаге), и только в считанных случаях ее применяют для идентификации отдельных аминокислот. [c.121]

Гомогенность образца по молекулярной массе может быть установлена с помощью методов ультрацентрифугирования или гель-фильтрации. Но эти методы менее чувствительны по сравнению с каскадными методами, в которых разделение макромолекул зависит от их суммарного заряда. Для установления чистоты белков, пептидов и олигонуклеотидов очень полезны методы зонного электрофореза, особенно при изучении электрофоретического поведения образца в нескольких буферных системах с различными значениями pH. С помощью ионообменной хроматографии также можно обнаружить присутствие примесей. Распределительная хроматография и противоточное распределение были успешно использованы при изучении лишь немногих белков из-за ограниченной растворимости и относительной нестабильности большинства белков в неполярных растворителях. Чистоту пептидов, содержащих до 40— 50 остатков аминокислот, можно во многих случаях установить с помощью хроматографии на бумаге. Часто макромолекулярное вещество, кажущееся гомогенным при исследовании одним мето- ом, оказывается негомогенным при использовании другого метода. На- [c.164]

При двумерном разделении в левый угол квадратной пластинки размером, например, 20X20 см наносят смесь веществ хроматограмму элюируют, высушивают и повторно элюируют в той же или в другой системе растворителей в направлении, перпендикулярном направлению первого проявления. Двумерная хроматография широко используется для разделения сложных смесей веществ (аминокислоты, пептиды). Иногда между первым и вторым разделениями смесь веществ подвергают химической или физической [c.97]

Метод противоточного распределения, разработанный Крейгом [36], был применен для разделения смесей аминокислот и очистки белков [187]. Так как полярные группы, определяющие растворимость аминокислот, одинаковы для различных аминокислот, коэффициенты распределения аминокислот различаются незначительно, и, следовательно, их разделение становится трудной задачей. При ацетилировании [172] или образовании нипсиль-ных производных (/г-иодфенилсульфонилпроизводные) [94] фракционирование облегчается за счет уменьшения влияния полярных групп. Хроматографические методы значительно более эффективны по разрешающей способности, но они ограничены возможностью выделений сравнительно небольших количеств веществ. Успешное применение метода противоточного распределения зависит в значительной степени от подходящего выбора двухфазной системы растворителей. Кроме того, применение этого метода ограничивается возможностью разделения веществ низкого молекулярного веса 10 ООО), за исключением тех случаев, когда пептиды обладают большой устойчивостью к денатураций. В присутствии большинства двухфазных систем растворителей, как правило, легко происходит денатурация белков. Однако при нахождении благоприятных условий противоточное распределение-имеет преимущество по сравнению с другими методами, так как при этом возможно рассчитать коэффициенты распределения компонентов, которые могут быть установлены с большой точностью. Профиль кривой распределения дает хороший критерий чистоты вещества. [c.397]

Со времени классической работы Консдена, Гордона и Мартина [1 ] и более поздней работы Дента [2] было предложено очень много различных систем для разделения аминокислот при помощи хроматографии на бумаге. Некоторые исследователи ставили перед собой задачу получить наилучшее разделение определенных групп аминокислот, другие добивались максимального разделения большого числа компонентов. Многие авторы достигали цели, проводя хроматографирование в течение суток, однако в более сложных случаях для четкого разделения требовалась целая неделя. Ковкабани и Кессиди [3] испытали 22 сорта фильтровальной бумаги с пятью различными системами растворителей и еще 53 сорта фильтровальной бумаги с двумя различными системами растворителей. Вслед за ранними исследованиями [4, 5], посвященными влиянию неорганических солей на результаты хроматографии на бумаге, Мак-Фаррен [6] подробно исследовал влияние широкого диапазона pH на движение аминокислот. За 10 лет (1944 — 1954) по вопросам хроматографии на бумаге было опубликовано свыше 1200 обстоятельных работ, не считая большого числа кратких сообщений на эту тему. Сегодня огромный ворох литературы ставит в тупик начинающего исследователя большие трудности испытывает и обозреватель, пытающийся кратко изложить этот вопрос. [c.9]

Для оптимального разделения некоторых аминокислот, плохо отделяющихся друг от друга в перечисленных системах, используют п другие растворители, которые приведены в соответствующих руководствах (см., например Хроматография на бумаге//Под ред. И. Хайса и К. Мацека. М., 1962). Так, для отделения валина от фенилаланина (проблема, возникающая при анализе антибиотика грамицидина С. состоящего всего из пяти разных аминокислот) можно рекомендовать последовательное пропускание двух растворителей систему 2-бута-нол — 3%-ный аммиак (3 1), а затем систему н-бутанол — уксусная кислота — вода (8 3 1). [c.129]

Большое распространение в последнее время получила хроматография на полиамиде (е-поликапролактаме). Было показано, что полиамиды в зависимости от способа получения обладают различной разделительной способностью [154]. В качестве связующего для полиамидных слоев хорошо зарекомендовала себя целлюлоза [43, 154]. Полиамид применяли также и для приготовления незакрепленных слоев [154]. Помимо целлюлозы в качестве связующего можно использовать крахмал. Слои с пре-красны.ми механическими свойствами мол<но получить из смеси полиамида, силикагеля и крахмала [94]. Полиамид пригоден для разделения фенолов. В этом случае при использовании водных систем растворителей характер разделения аналогичен получаемому при применении хроматографии с обращенными фазами, т. е, в системе с гидрофильной неподвижной фазой (см. разд. 3.2.1.3) [154]. Необходимо помнить, что элюотропный ряд растворителей в случае полиамида совершенно иной, чем применительно к другим сорбентам. Это объясняется разным характером взаимодействия между хроматографируемым веществом и сорбентом. Помимо фенолов в тонком слое полиамида хроматографировали антипиретики [54], тиаминовые производные [60], антибиотики [77], консервирующие вещества [57, 90], аминокислоты и их производные, нуклеозиды и нуклеотиды [163, 164] и другие соединения. Хроматографируемые вещества хорошо вымываются из полиамидного слоя, поэтому пластинки с полиамидом можно использовать для повторных разделений [163]. [c.41]

Блассу [ПО] удалось разделить ДНФ-лейцин и ДНФ-изолей-цин, применив длительное элюирование смесями толуол—2-хлор-этанол—пиридин—25%-ный аммиак (20 12 6 1) (в одном направлении) и хлороформ—-грег-амиловый спирт—уксусная кислота (95 5 1) (8 ч в другом направлении). С помощью системы Бреннера и др. [107] этого сделать не удалось. Вальц и др. [111] использовали разделение производных динитрофенила для обнаружения аминокислот в моче. Общее разделение проводили по методу Бреннера и др. [107]. Кроме основных растворителей эти авторы применяли еще четыре вспомогательных растворителя толуол—пиридин—этиленхлоргидрин—25 %-ный гидроксид аммония (50 35 15 7), хлороформ—метанол— уксусная кислота (70 30 5), пиридин и н-бутанол, насыщенные 25 %-ным гидроксидом аммония при комнатной температуре. Результаты исследования показали, что разделение следует проводить двумерным хроматографированием при многократном элюировании. [c.500]