Секвенирование целых геномов

Молекулярная биотехнология — это увлекательнейшая область научных исследований, с появлением которой произошел настоящий переворот во взаимоотношениях человека с живой природой. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой, осуш ествляемый методами генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК). В большинстве случаев целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах. В ч. I мы познакомим читателя с концепциями молекулярной биотехнологии и теми микроорганизмами, которые в ней используются, с основами молекулярной биологии и методологией рекомбинантных ДНК. Будут описаны такие методы, как химический синтез генов, полимеразная цепная реакция (ПЦР), определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Помимо успешного клонирования нужного гена очень важно обеспечить его правильное функционирование в организме нового хозяина, поэтому мы остановимся также на способах оптимизации работы клонированных генов в про- и эукариотических системах. И наконец, мы рассмотрим, как можно улучшить свойства конечных продуктов, модифицируя клонированные гены путем введения в них специфических нуклеотидных замен (мутагенез in vitro). В целом материал, изложенный в первой части, служит фундаментом, который позволяет понять различные аспекты конкретных применений молекулярной биотехнологии. [c.13]

Точнейшей из операции по анализу строения генов и способов их регулирования является секвенирование. Секвенирование ююнированных генов зачастую проводят также в тех случаях, когда оптимизируют их экспрессию. Секвенирование геномов помогает не только изучать их структуру, но и понять пути их эволюции. В практическом плане секвенирование важно для приготовления зондов с целью диагностики генетических заболеваний, идентификации микроорганизмов и т. д. [c.269]

С самого начала своего существования HGP должна была решать этические, правовые и социальные проблемы, связанные с картированием и секвенированием генома человека, вырабатывать стратегию, тактику и разрабатывать законопроекты, гарантирующие ответственное использование информации по генетике человека. На самом деле HGP не ставит каких-либо принципиально новых этических, правовых или социальных вопросов, которые не возникали бы при проведении медико-генетических исследований в целом. Однако реализация HGP неизбежно приведет к идентификации большого числа генов различных заболеваний и к определению последовательности многих из них, и эта [c.478]

Синтетические олигонуклеотиды используются в качестве линкеров или адаптеров для облегчения встраивания ДНК в векторы, затравок для ферментативного синтеза ДНК, а также затравок при секвенировании ДНК и РНК. Их применяют для сайт-направленного мутагенеза и как контрольные элементы для изучения экспрессии генов. Синтетические нуклеотиды используют также для конструирования полных генов. В зависимости от цели использования их длина варьирует от 5 до 60 нуклеотидов. Трудности, возникающие при получении длинных олигонуклеотидов, связаны не с собственно их синтезом, а с очисткой материала. [c.88]

Одна из стратегий идентификации гена заболевания в отсутствие данных о продукте этого гена и каких-либо генов-кандидатов. В подобных случаях сначала определяют хромосомную локализацию (позицию) гена. Затем получают геномные клоны, охватывающие картированный сайт (используя соответствующие маркеры), идентифицируют и анализируют присутствующие в них экзоны. Используя целый ряд методов (идентификация G -островков, улавливание экзонов, секвенирование, компьютерный анализ и т.д.), определяют, какой именно ген ответствен за данное заболевание. [c.556]

Участки ДНК, по которым происходит расщепление той или иной рестрикта-зой, называют сайтами рестрикции. Поскольку эндонуклеазы рестрикции используются не только для подготовки ДНК к секвенированию, но и для других целей, в частности для генной инженерии (см. 7.11), распределение сайтов рестрикции вдоль молекулы ДНК является важной характеристикой ДНК. Установление взаимного расположения этих сайтов называют физическим картированием ДНК, а саму схему такого распределения — физической картой ДНК. [c.276]

Секвенирование нуклеиновых кислот в настоящее время стало рутинным методом молекулярной биологии. Несомненно, в ближайшем будущем появятся еще более совершенные автоматические секвенаторы, что приведет к резкому увеличению числа расшифрованных последовательностей. В настоящее время расшифровано около 100 тыс. фрагментов различных геномов, а также ряд целых геномов небольшого размера (в сумме около 35 млн нуклеотидов). Однако, с биологической точки зрения, это совсем немного. Все расшифрованные последовательности составляют примерно 10 книг по 1000 страниц или суммарную длину генома пяти бактерий, а геном человека, например, составит несколько тысяч таких книг. [c.4]

В последнее десятилетие мы стали свидетелями целой серии ошеломляющих успехов в области молекулярной биологии. Разработка надежных методов клонирования, секвенирования и анализа экспрессии эукариотических генов углубила наши представления о структуре и регуляции активности гена, сделала более понятными механизмы многих наследственных болезней человека, В это же время быстро развивались и достигли значительных успехов методы картирования человеческих генов. В сентябре 1987 г. в Париже состоялась конференция по проблеме картирования генома человека. На ней было доложено о локализации в общей сложности 1360 генов и сегментов ДНК в специфических участках хромосом. Процесс накопления данных в этой области носит лавинообразный характер. Заметим, однако, что при этом исследования по молекулярному клонированию и картированию с помощью анализа сцепления и методами генетики соматических клеток находятся на разных операционных уровнях (рис. 1). [c.95]

Дополнительные свойства. Они определяются целью клонирования генов. Поэтому больщинство векторов носит специализированный характер, т. е. их приспосабливают для решения узкого круга задач. Например, векторы, предназначенные для экспрессии генов, содержат около сайтов клонирования мощные промоторы, причем экспрессия может быть регулируемой или нерегулируемой конститутивной). Присутствие в таких векторах специальных сигнальных последовательностей обеспечивает секрецию продуктов клонируемых генов. Малокопийные векторы позволяют изучать, например, механизмы регуляции клонируемых генов, а мультикопийные способны умножать (амплифицировать) их число в сотни и тысячи раз. Разработаны векторы для секвенирования нуклеотидных последовательностей и для поиска в них определенных регуляторных сигналов — промоторов, терминаторов транскрипции. [c.191]

Для практических целей наличие при заболевании такой мажорной (наиболее часто встречающейся) мутации имеет большое значение, так как позволяет с большой эффективностью и с меньшими затратами осуществлять его молекулярную диагностику. В противоположном случае диагностика каждого нового больного требует, по сути, отдельного научного исследования - вплоть до секвенирования конкретных участков гена - что на сегодняшний день не может быть выполнено в клинических лабораториях. [c.316]

Итак, если линейную информационную макромолекулу ДНК сравнить с длинными полосами лент, которые использовали в первых компьютерах, то ДНК хромосом можно представить как последовательность миллионов букв (оснований). В этих последовательностях закодирован весь набор инструкций, представляющих генетический материал всех живых клеток на Земле. Проект Геном человека поставил целью определить порядок этих букв во всех 22 парах аутосом и в двух половых хромосомах человека. Этой работой занимается целый ряд специализированных лабораторий мира, владеющих методами клонирования и секвенирования генов. В общедоступных базах данных и в персональных компьютерах молекулярных биологов хранятся сотни файлов, содержащих информацию о тысячах (может быть, миллионах) последовательностей ДНК. Достижения компьютерных технологий дают возможность биологам манипулировать последовательностями (например, искать определенную последовательность, разрезать ее или вставлять дополнительную информацию). Можно смело утверждать, что для появления ряда новых открытий молекулярной биологии было необходимо развитие современных компьютерных технологий (табл. 2.1). [c.50]

Наши представления о геноме человека — обширная область генетики человека, включающая по меньшей мере понятия инвентаризации генов, фупп сцепления, картирования генов (локализация), секвенирования всей ДНК (генов, их мутаций и хромосом в целом), мейотических преобразований, функционирования отдельных генов и их взаимодействий, интеграции структуры и функции генома в целом. На решении всех этих вопросов была сосредоточена обширная многолетняя международная программа Геном человека (с 1990 по 2000 г.). Главным направлением работ были последовательное секвенирование участков генома и их состыковка . Успешные разработки в этой области придали программе клинико-генетический аспект (табл. 1.5). [c.18]

Подчеркнем в заключение, что описанные методы скрининга — это лишь способ поиска клонов, которые могут содержать целый ген и в которых возможен синтез интактных белков. Судить о целостности клонируемого гена и синтезируемого белка можно только после дополнительно о анализа (как правило, после секвенирования). [c.288]

Данный способ незаменим для секвенирования областей ДНК, размер которых превышает 10 т.п.н. В этих случаях получают субклоны фрагментов ДНК размером 3—5 т.п.н., каждый из которых секвенируют по отдельности. Именно так впервые был секвени-рован целый геном — ДНК фага X, содержащий 48502 п.н. [c.308]

Всего было синтезировано 56 олигонуклеотидов длиной 40 звеньев, кодирующих обе цепи целевого дуплекса. Разбиение на олигонуклеотиды осуществлено таким образом, чтобы каждый из НИХ перекрывался с соседними фрагментом длиной в 20 нуклеотидов. Ген Ыа был фланкирован для удобства клонирования сайтами рестриктазы 1. В целом ген синтезирован в 4 стадии синтез олигонуклеотидов, сборка гена, амплификация гена, клонирование искусственного гена в pU 322. 76 % полученных при клонировании колоний имели ожидаемый фенотип Тс Однако единственный секвенирован-ный клон имел в составе целевого гена три мутации. [c.76]

Еьгстрые успехи технологаи рекомбинантной ДНК позволят в ближайшее время секвенировать длинные отрезки ДНК при сравнительно небольших затратах. Это значит, что станет возможным секвенирование целых геномов бактерий, дрожжей, нематод и Drosophila, а также обширных участков ген ома различных высших растений и позвоночных животных, в том числе и человека [c.343]

Internet Line). Они созданы исходя из некоторых характерных для экзона особенностей. Одна из них - ожидаемая нуклеотидная последовательность кодирующей области. Если лаборатория оснащена оборудованием для широкомасштабного секвенирования, можно секвенировать геномные клоны, охватывающие область расположения искомого гена, и провести компьютерную обработку полученных данных с целью выявления экзонов. Нуклеотидную последовательность предполагаемого экзона можно использовать для поиска гомологичных ей последовательностей в генной базе данных или синтезировать на ее основе олигонуклеотидный зонд для скрининга кДНК-библиотеки. Наконец, как и в случае других методов идентификации экзонов в геномных клонах, необходимо доказать, что предполагаемый экзон является частью гена-мишени. [c.476]

ВекторыpGEM. Описанные плазмидные векторы пригодны лишь для клонирования генов в клетках Е. соН и родственных им грамотрицательных бактерий, например. Salmonella и Serratia. Они универсальны — их используют для самых разнообразных целей. В то же время сконструировано много специальных векторов, приспособленных, например, только для идентификации регуляторных сигналов, для суперпродукции чужеродных белков и их секреции, для секвенирования ДНК, экспрессии генов животных в [c.201]

Определение первичной структуры ДНК долгие годы оставалось неразрешимой задачей. В 70-х гг XX в. с открытием ферментов рестриктаз, разрезающих молекулы ДНК в строго определенных точках, А. Максамом и В. Гилбертом был разработан метод секвенирования, позволяющий определять последовательности до 1000 нуютеотидов. В 1985 г удалось создать прибор для автоматического анализа нукнеиновых кислот. В последнее десятилетие в этой области наметился существенный прогресс, в результате чего определена последовательность не только отдельных генов, но и целых хромосом у разных видов живых организмов, в том числе и человека. Все данные по структуре генов, публикующиеся в мировой научной литературе, вводятся в память компьютера, формируя банк данных. [c.178]

Разработка методов клонирования и определения последовательности оснований (секвенирования) нуклеиновых кислот положило начало новому этану развития молекулярной биологии. Знание первичной структуры участков генома, выполняющих определенные функции, дало возможность эффективно применить для их исследования целый арсенал новых методов генной инжонер11и. Зти методы (направленный мутагенез, рекомбинация in vitro и др.) позволяют модифицировать участки нуклеотидных последовательностей и исследовать их функции на молекулярном уровне. С их помощью комбинируются участки генетического материала и создаются геномы с совершенно новыми функциями. С другой стороны, эпоха массового секвенирования нуклеотидных последовательностей по-новому ставит две кардинальные проблемы биологии проблему структура-функция и проблему молекулярной эволюции. [c.4]

Одна из наиболее часто возникающих проблем при анализе биологических текстов - поиск гомологий. И это понятно, поскольку схожесть текстов позволяет делать выводы об их эволюционной и/или функциональной близости. Здесь можно привести пример обнаруженной гомологии между определенными типами онкогенов и клеточными генами (НаЬагго et а1., 1984), что привело к возникновению нового направления исследований. Гомологии между последовательностями часто используют для реконструкции эволюционных деревьев. Такие важные аспекты анализа биологических текстов, как поиск повторов, палиндромов, симметричных участков, сайтов рестрикции, также связаны с проблемой поиска гомологий. Анализ гомологий необходим также при подготовке и проведении целого ряда экспериментальных работ, в частности при синтезе олигонуклеотидных зондов для поиска клонов в клонотеке, стыковке фрагментов нуклеотидных последовательностей при секвенировании протяженных участков ДНК или целых геномов и др. [c.11]

Как можно видеть из приведенных схем, наибольшее число консервативных участков локализовано в имеющемся у всех ферментов (что вполне естественно) домене, отвечающем за полимеразную активность. Некоторые из этих участков связываются с ДНК, а другие с дНТФ и ионами магния. Этому домену предшествует домен, выполняющий редактирующие функции в виде 3 — 5 -экзонуклеазной активности. У термостабильных ДНК-полимераз в этом домене имеется только один консервативный участок (Taq ДНК-полимераза) или они все отсутствуют (Bst ДНК-полимераза), вследствие чего оба этих фермента лишены подобной редактирующей активности. КН2-терминальный домен у ДНК-полимеразы I несет репарирующую 5 — З -экзонуклеаз-ную активность. Подобную активность проявляют обе упомянутые выше термостабильные ДНК-полимеразы, что, вероятно, объясняет обнаруженную у них некоторую гомологию этого участка с аналогичным у ДНК-полимеразы I. Что касается большинства ДНК-полимераз, модифицированных с целью их большей пригодности для ферментативного секвенирования ДНК либо ограниченным протеолизом, либо специально созданных генно-инженерным путем, то их объединяет общая черта, заключающаяся в удалении имеющейся у их предшественников 5 — 3 -экзонуклеазной активности. Путем делеции нескольких аминокислотных остатков во втором экзонуклеазном домене Т7 ДНК-полимеразы была убрана имевшаяся 3 — 5 -экзонуклеазная активность. Сайтнаправленный мутагенез двух аминокислот в экзонуклеазном домене Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I привел к удалению 3 —> 5 -экзонуклеазной активности этого фермента. Как можно представить из приведенных схем, столь разные структурные организации рассматриваемых ферментов не могли не сказаться на особенностях их ферментативного действия, чему и будет посвящено дальнейшее изложение. [c.83]

В 1995 г. стали известны нуклеотидные последовательности двух прокариотических геномов. 1996 г. увеличил число таких геномов до 5 и добавил еще и один эукариотический геном. В 1997 г. было завершено секвенирование сразу 6 бактериальных геномов. Столько же новых геномов с определенной последовательностью нуклеотидов уже принес 1998 г. и в декабре предполагается завершение секвенирования генома еще одного эукариотического организма - нематоды aenorhabditis elegans. Можно ожидать, что в 1999 г. темпы расшифровки последовательности нуклеотидов полных геномов различных организмов еще увеличатся. Также не вызывает сомнений, что секвенирование полных геномов различных организмов станет важной задачей молекулярных биологов следующего столетия и продолжающееся бурными темпами развитие необходимой для этого техники (включая разработку новых подходов к секвенированию ДНК, создание соответствующих приборов, компьютерное обеспечение) сделает со временем подобные задачи весьма обычным делом, хотя и дорогостоящим. Пока же секвенирование геномов (особенно крупных) представляет собой трудную задачу, справиться с которой в обозримые сроки можно только при условии объединения усилий сразу нескольких исследовательских групп. В то же время, помимо непосредственного секвенирования полных геномов, все большее значение приобретает функциональная геномика, направленная на выяснение механизмов функционирования отдельных генов и их взаимодействия в составе целого организма. Именно в этом случае секвенирование геномов дает те сведения, которые от него ожидают, поскольку отдельные новые гены, которые становятся известны в результате секвенирования какого-либо полного генома, могли бы быть клонированы и секвенированы обычным путем и не они представляют собой главную цель подобных проектов. Но, учитывая огромный объем уже сейчас известной информации в виде последовательности нуклеотидов, можно представить, что пройдет еще много времени, пока станут детально известны особенности функционирования хоть какого-нибудь небольшого генома. [c.381]

С развитием новых технологий молекулярных исследований, основанных на быстрых методах работы с ДНК (клонировании фрагментов ДНК генноинженерными способами и с помощью полимеразной реакции, автоматизированном секвенировании), с введением в практику молекулярногенетических исследований компьютерных технологий сравнительного анализа строения гено.мов представителей разных систематических групп, с развитием техники направленного воздействия на генетический аппарат клетки и организма в целом и возможности создания искусственных ферментов по нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК темпы развития молекулярной генетики обрели стремительный характер и привели к возникновению в конце 80-х гг. международной программы Геном человека . Этот глобальный проект предполагает к 2005 г. завершить определение полной последовательности всех трех миллиардов нуклеотидных звеньев, составляющих геном человека. Принятие такой программы означает, что характер развития молекулярной биологии достиг совершенно нового уровня. Произошедший качественный скачок в технологии позволяет решать принципиально новые задачи. [c.72]

Смотреть страницы где упоминается термин Секвенирование целых геномов: [c.366] [c.29] [c.38] [c.462] [c.477] [c.480] [c.885] [c.10] [c.64] [c.97] [c.307] [c.311] [c.24] [c.204] [c.79] [c.84] [c.88] [c.228] [c.294] [c.298] [c.322] [c.371] [c.377] [c.382] [c.382] [c.401]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология