Пепсин хроматография

Рассмотрим теперь метод пептидных карт. Его первый этап состоит в разрыве дисульфидных связей, далее белок денатурируют и расщепляют ферментами, например трипсином или пепсином. В результате получается набор пептидов, размер и аминокислотный состав которых характерен для каждого отдельного белка. Смесь пептидов наносят на лист хроматографической бумаги и проводят в одном направлении хроматографию, а в другом — электрофорез. Пептиды локализуются в виде отдельных пятен, образуя характерную картину ( отпечатки пальцев ), Метод пептидных карт особенно полезен для выявления малых [c.167]

Метод составления пептидных карт, получивший образное название метод отпечатков пальцев , используется при определении сходства или различия гомологичных белков по первичной структуре. Белок инкубируют с каким-либо протеолитическим ферментом. Часто порции белка инкубируют как с пепсином, так и с трипсином. При этом вследствие гидролиза строго определенных пептидных связей образуется смесь коротких пептидов, легко разделяемых с помощью хроматографии в одном направлении и электрофореза-в другом, под углом 90° от первого (пептидная карта). [c.56]

Нативная рибонуклеаза не чувствительна к действию трипсина и химотрипсина. Поэтому сначала проводили окисление рибонуклеазы (остатки цистина при. этом окислялись до остатков цистеиновой кислоты) и окисленный препарат подвергали затем действию протеолитических ферментов. При помош,и хроматографии на дауэкс 50-Х-2 [82] из триптического гидролизата было выделено 15 пептидных фрагментов [82], а из гидролизата после действия химотрипсина — 32 фрагмента [83]. Для количественного определения аминокислотного состава выделенных пептидов и для достижения их чистоты необходимо использовать достаточное количество исходного материала (200 мг). Фракции, содержащие более одного компонента, подвергают повторному фракционированию в несколько измененных условиях. Расщепление с помощью пепсина [6], хотя оно и не столь селективно, позволяет, однако, получить другие пептиды, которые помогают воссоздать полную структуру рибонуклеазы. [c.415]

Первыми ферментами полученными в кристаллическом виде, были уреаза (выделенная в 1926 г. Самнером) и пепсин (выделенный Нортропом в 1929 г.). Самнер и Нортроп получали ферменты в кристаллическом состоянии путем высаживания их из растворов сульфатом аммония, спиртом, ацетоном и другими химическими реагентами. В последние годы благодаря использованию новых эффективных методов очистки ферментов (электрофорез, ионообменная хроматография, противоточное распределение, гель-фильтрация) и модернизации уже известных методов их выделения и очистки удалось получить сотни химически однородных кристаллических препаратов ферментов. [c.199]

ПРИМЕНЕНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ИНГИБИТОРОВ В ХРОМАТОГРАФИИ ПЕПСИНОВ [c.187]

Для разрушения пептидной части гликопротеинов широко применяется протеолиз, особенно часто под действием проназы (обычно из 81гер1от св5 г15тч), которая является набором мощных протеиназ, способных разрушать пептидные цепи, устойчивые к другим протеолитиче-ским ферментам. Часто употребляются также трипсин, химотрипсин, па-паин. Гидролизат, полученный после обработки протеиназами, подвергают фракционированию с применением диализа, гель-фильтрации и хроматографии (см., например, ), выделяя один или несколько низкомолекулярных гликопептидов, структуру которых устанавливают обычными методами и иногда подтверждают встречным синтезом. Впервые гидролиз гликопротеина трипсином был применен Нейбергером для выделения фрагмента овальбумина, содержащего узел связи олигосахаридной и пептидной части молекулы в дальнейшем для этой же цели использовали также химотрипсин, пепсин и другие фepмeнты " . . Протеолиз проназой очень широко применялся при выделении узловых фрагментов из 7-глобулина , тиреоглобулина фибриногена и особенно му- [c.571]

Электрографические измерения (комбинация электромиграции и хроматографии) могут быть описаны уравнениями, аналогичными уравнению (18-15), в которых 3 является средней ионной подвижностью центральной группы, а вцп — ионной подвижностью BHjA . Степанов и Шведов [60] изучили этим способом ацидокомплексы цитратов лантанидов и нашли константы устойчивости методом последовательной экстраполяции. Аналогичным образом можно использовать кинетические данные например, константы устойчивости системы пепсин — альбумин — протон были рассчитаны из зависимости скорости реакции взаимодействия пепсина с альбумином от концентрации водородных ионов [6а]. [c.486]

Рис. 34.2. Гель-проникающая хроматография гидролизата, полученного при обработке бромцианом 8-сульфоннлпроизводного пепсина свиньи [21].

Среди протеаз пепсин был одним из первых ферментов, очищенных гель-хроматографией на сефадексе G-50 [1]. Перед кристаллизацией двух новых протеаз растительного происхождения — агаваина[2]и пингви-наина [3] — решающим этапом очистки была гель-хроматография на сефадексе G-100. При изучении автолиза и оценке молекулярного веса также применяли [c.212]

Физико-химические свойства ферментов обусловлены их белковой природой. Ферменты не диализируют сквозь полупроницаемые мембраны, способны высаливаться и дают характерные для белка цветные реакции и реакции осаждения. При выделении ферментов методами высаливания, фракцио-нировйния ацетоном и колоночной хроматографии они не теряют каталитических свойств, что позволяет выделять активные ферментные препараты для практических целей (пепсин, трипсин, амилаза, липаза и др.). [c.99]

Из других работ по хроматографии пептидов на целлюлозных сорбентах следует назвать работы по выделению активных фрагментов из автолизата пепсина на ДЭАЭЦ и КМЦ [9] по разделению пептидных цепей фибрина [10] по разделения В- и С-цепей а-химотрипсина [И] по разделению пептидов из ферментативного [c.185]

В настоящее время при помощи хроматографии производят полное удаление солей из воды (получение дистиллированной воды без перегонки), разделение сложных смесей аминокислот и гидролизатов белков (см. рис. 56), разделение сложных смесей фосфоса-харидов, пуриновых и пиримидиновых оснований (рис. 57), фракционирование белков (цитохрома, рибонуклеазы, инсулина и др.), фракционирование нуклеиновых кислот и различных полимеров, отделение пепсина, трипсина, алкогольдегидрогеназы, очистку антител, выделение стрептомицина, хлортетрациклина, полимиксина и других антибиотиков, а также алкалоидов, гормонов, антигиста-минных веществ. Большой интерес представляет также терапевтическое использование ионообменных смол для регулирования состава ионной среды в желудочно-кишечном тракте и для диагностических целей. [c.116]

Рис. 6.10. Прерывающаяся рециркуляционная хроматография трипсинового гидролизата аминометилированного фрагмента пепсина СВ 2 [34].

На следующем этапе исследования белок подвергают ферментативному гидролизу на пептиды, например под действием трипсина, химотрипсина и пепсина. Разделение пептидов осуществляют с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге. Затем, пользуясь ДНФБ-методом, определяют аминокислотную последовательность, начиная с Ы-конца. [c.289]

Однако на примере ряда ферментов, и рибонуклеазы в частности, было показано, что не бся молекула, а лишь некоторая ее часть (активный участок) ответственна за каталитическую активность. Так, Ричардс, используя фермент субтилнэи /, расщепил молекулу рибонуклеазы по связи между звеньями 20 и 21 (пептидная связь Ala — Ser), и при этом вторичная и третичная структуры удержали молекулу как целое. Сохранились и ферментативные свойства. Но при хроматографии на кислом ионообменнике короткий пептид из 20 аминокислотных остатков отделился от остальной части. Обе части молекулы были лишены ферментативной активности, однако прн сменгении их активность вновь возникала. У отделенной больпк й части белковой молекулы еще сохранилась способность связывать обычный для рибонуклеазы субстрат ферментативной реакции, но не расщеплять его. П])и гидролизе рибонуклеазы карбоксипептидазой и отщеплении с С-коица трех аминокислот — валина, серина и аланина активность рибонуклеазы не страдает. При гидролизе пепсином разрывается четвертая связь с С-конца и отщепляется кроме валина, серина и аланина еще н аспарагиновая кислота. Тогда остаток рибонуклеазы полностью теряет активность. Подобным же образом устанавливается существенность двух остатков His в положениях 12 и 119. Сказанное имеет целью дать понятие об исследовании структуры белка как фермента. [c.703]

Бурильон и сотрудники также показали, что -кислый гликопротеин может расщепляться протеолитическими ферментами. Изучая действие этих ферментов на препараты, выделенные из плевральной жидкости человека, эти авторы обнаружили, что трипсин наиболее активно расщепляет гликопротеин, а затем в порядке убывания активности идут пепсин, папаин и химотринсин [138]. Смесь, полученная в результате последовательного действия всех трех ферментов, разделялась при зональном электрофорезе на три компонента, а при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе — на пять компонентов. При определении коэффициентов седиментации этих фракций были обнаружены очень небольшие различия. Найденные коэффициенты седиментации соответствовали молекулярным весам от 3000 до 3500, Содержание углеводных компонентов в них также было очень сходно, за исключением количества гексозамина. Все гликопептиды содержали одни и те же семь аминокислот (кроме валина), но их молярные соотношения сильно варьировали. На ]Ч-концах были обнаружены четыре различные аминокислоты [25]. [c.92]

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекуляр-1ЮЙ массы (до 40 000). Крупные фрагмеггты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракцио- шрования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко ие ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембран11ые белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях на полиакриламидных гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые [c.352]

Нерастворимые (кбровые) пептиды могут быть солюбилизированы и затем разделены в денатурирующих условиях, но, как правило, более выгодно проводить их предварительную фрагментацию. Для гидролиза смеси труднорастворимых алифатических пептидов используют эластазу или термолизин, для пептидов ароматического характера — химотрипсин или пепсин при кислых pH. Образовавшиеся фрагменты разделяют хроматографией на бумаге или, если кор составляет значительную часть молекулы белка, на колонке дауэкс-50 с окончательной очисткой полученных фракций на бумаге. [c.357]

Рис. 18. Аффинная хроматография пепсина свиньи на колонках с е-амино-капроил-L-Phe-D-Phe-OMe- enapoHOM с низкой (а) и высокой (6) концентрациями иммобилизованного ингибитора [72], Концентрация ингибитора мкмоль/г сухого носителя) а — 0,85 б—155. 1 — концентрация белка 2 —

Первые исследования белков проводились со сложными белковыми смесями, такими, как яичный белок, сыворотка крови, экстракты из растительных и живот ных тканей, а подчас и цельные ткани. Лишь в конце XIX в. получили распространение методы разделения белков с помош ью осаждения нейтральными солями. В 30-е годы XX в. были получены первые белки в кристаллическом состоянии. Получение веш ества в кристаллическом виде служит одним из надежных доказательств чистоты (гомогенности) препарата. В частности, в 1926 г. Д. Самнер выделил из семян канавалии белок (фермент) уреазу в кристаллическом состоянии Д. Нортроп и М. Кунитц в 1930-1931 гг. получили кристаллы пепсина и трипсина. После этих пионерских работ выделение индивидуальных белков стало частым событием в истории биохимии, особенно после 50-х годов, когда начали применять современные методы фракционирования — хроматографию на гидрофильных ионообменниках, гель-фильтрацию ( молекулярное просеивание ), новые методы электрофореза и др. [c.17]

Смотреть страницы где упоминается термин Пепсин хроматография: [c.464] [c.410] [c.226] [c.307] [c.304] [c.184] [c.184] [c.29] [c.169] [c.101] [c.110] [c.259] [c.784] [c.179] [c.278] [c.93] [c.93] [c.188] [c.379] [c.247] [c.304]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология