Ацилфермент

Этот новый тетраэдрический интермедиат в конечном счете приведет к образованию цисоидного промежуточного ацилфермента, который, видимо, и будет основным продуктом. [c.250]

Возможен также поворот на 120" группы —ОСНз. В этом случае эфирная группа меняет конформацию по отношению к группе К с транс- на гош-. Этот новый тетраэдрический интермедиат, а также исходный приводят к образованию трансоидного промежуточного ацилфермента после отщепления —ОСНз-группы, которому способствует взаимодействие с орбиталями. [c.250]

В ЭТОМ случае стерическое напряжение не столь велико, как в предыдущем, и такой интермедиат расщепится с преимущественным образованием трансоидного ацилфермента. [c.251]

Многостадийный характер превращения субстрата на активном центре химотрипсина [6—101. Гидролиз субстратов (сложных эфиров,. амидов) на активном центре химотрипсина протекает в несколько стадий. На первой стадии ферментативного процесса происходит сорбция субстрата (образование комплекса Михаэлиса Е5). На последующих стадиях наблюдается химическое превращение сорбированной молекулы с промежуточным образованием ацилфермента ЕА. В кинетической схеме [c.128]

В случае специфических субстратов промежуточный ацилфермент — весьма нестабильное соединение (время жизни - 0,01 с) [26, которое гидролизуется под действием воды с образованием кислоты и регенерацией свободного фермента. [c.129]

Рис. 32, Строение активного центра в ацилферменте по Хендерсону [18]

На стадии ацилирования происходит нуклеофильная атака карбонильного углерода субстрата обобщенным нуклеофилом активного центра 8ег-195... Н1з-57... Азр-102. В результате ацилирования активного центра происходит поворот остатка 8ег-195 вокруг С —Ср-связей, что сопровождается перемещением атома кислорода на- 2,5А. При этом имидазольная группа Н1з-57 перемещается в сторону растворителя [18]. В результате имидазольная группа Н13-57, будучи включенной в свободном ферменте (и, по-видимому, в комплексе Михаэлиса) в водородную связь с 8ег-195 (рис. 31), в ацилферменте предоставляет свой М атом для образования водородной связи с водой (рис. 32). В итоге активированная молекула воды приобретает способность эффективно атаковать карбонильный- углерод субстрата на стадии деацилирования. При этом образуется кислотный продукт гидролиза и регенерируется свободный фермент. Таков в общих чертах химический механизм гидролитического действия химотрипсина. [c.131]

Что касается природы сорбционного взаимодействия фермент — субстрат, то следует подчеркнуть, что с точки зрения термодинамики образование водородной связи (как это предполагает модель Хендерсона, см. рис. 32) представляется вполне разумным, поскольку энтальпия ее в аполярной среде достаточно велика —(4—6) ккал/моль, т. е. —(16,8—25,2) кДж/моль) [59, 72], чтобы компенсировать необходимые для реакции потери энтропии при внутримолекулярном замораживании в ацилферменте вращательного движения субстратного остатка. [c.138]

Рис. 42. Зависимость специфического эффекта S в реакции гидролиза ацилферментов типа R (0)E от показателя гидрофобности я субстратной группы R [21], если заместители R

Рассмотрим экспериментальные данные по кинетике гидролиза промежуточных ацилферментов типа К—С(0)—Е, представленные на рис. 42. В случае ацилферментов, содержащих в субстратном остатке разветвленную или достаточно короткую нормальную алифатическую цепь (точки 1—12), константы скорости деацилирования укладываются в следующее корреляционное уравнение [21] [c.148]

Как видно из последнего уравнения, изменение реакционной способности этих ацилферментов обусловлено лишь стерическим и индукционным а влиянием субстратного остатка. [c.148]

Совершенно иной представляется картина в случае ацилферментов, производных нормальных алифатических карбоновых кислот, типа Н(СН2) С(0)Е. Эти соединения обнаруживают резкие отклонения от линейной зависимости (4.26),как это видно из рис. 42 (точки 13—16), [c.148]

При последующем гидролизе промежуточного ацилфермента [уравнения (4.2—4.5)] нуклеофильную атаку осуществляет молекула воды, реакционная способность которой усилена взаимодействием ее с имидазолом Н15-57 (см. рис. 32). Возможно, карбоксильная группа Азр-102 принимает участие также и на этой стадии [c.157]

Рентгеноструктурные исследования показали, что помимо серина-195 в активный центр входят также остатки гистидина (Н1з-57) и аспарагиновой кислоты (А5р-102). Другой остаток гистидина (Н1з-40) не участвует в катализе. Фермент обладает специфичностью к ароматическим аминокислотам. Эфиры ароматических аминокислот — хорошие субстраты этого фермента, и для большинства кинетических исследований в качестве субстратов использовались такие эфиры. Фермент расщепляет пептиды, освобождая карбоксильную группу ароматических аминокислот. После образования комплекса Михаэлиса единственный реакционноспособный 5ег-195 вначале ацилируется, образуя ацилферментное промежуточное соединение с субстратом. Превращение комплекса Михаэлиса в ацилфермент происходит сначала путем образования тетраэдрического интермедиата (разд. 4.4.1), и наконец происходит гидролиз ацилфермента при атаке молекулой воды, так что ацилированный продукт обычно не накапливается. [c.220]

Получены данные о том, что в процессе гидролиза я-анилид-ных производных пептидов, катализируемом сериновой протеа-зой из Myxoba ter 495, которую называют а-литической протеа-зой, возникает тетраэдрический интермедиат и происходит согласованный переход протона от Ser-195 к His-57 и от His-57 к Asp-102. В этом ферменте присутствует только один остаток гистидина [82, 83]. Стадией, лимитирующей скорость гидролиза, является разложение тетраэдрического интермедиата на ацилфермент и п-нитроанилин. Экспериментальные данные говорят в пользу того, что два перехода протонов осуществляются согласованно, а не последовательно. [c.221]

При pH 7, 25°С константа скорости этой реакции (200 мин ) сравнима с константой для расщепления /г-нитрофенолята а-химотрипсином (180 МИН ). Стадией, определяющей скорость реакции, является ацилирование (/гг). В первом приближении это удовлетворительная модель для имитации образования промежуточного ацилфермента, хотя Н1з-57 в а-химотрипсине действует как общеосновной — общекислотный, а не нуклеофильный катализатор. [c.226]

В реакции полимерных или олигомерных субстратов, где наблюдается несколько разных по своей природе сорбционных эффектов, ускорение реакции за счет стабилизации (концентрирования) переходного состояния может быть огромным, как, например, при гидролизе сложноэфирной связи в пептидных п-нитрофенилкарбоксилатах, катализируемом папаином. Ферментативный процесс идет через промежуточное образование ацилфермента, образующегося при ацилировании субстратом остатка Суз-25 (см. схему на стр. 19, где X — это п-нитро- [c.47]

Нерешен также и вопрос о ковалентном катализе. В ряде ферментативных реакций образуются промежуточные соединения с ковалентной связью между ферментом и субстратом [29, 48, 49]. В качестве примера можно указать на протеазы, где в ходе ферментативной реакции образуется ацилфермент (см. гл. IV). Трудно сказать, почему реакция не протекает прямо, а идет через образование промежуточного соединения с ферментом (или коферментом). В этом отношении Дженкс [29] указал, что именно здесь могут быть заложены важные химические закономерности ферментативного катализа, которые в настоящее время почти или вообще не поняты . Не исключено, однако, что причина простая, а именно, что в ковалентно-связанном промежуточном соединении легче, чем в сорбционном фермент-субстратном комплексе, реализуются различного рода механизмы напряжения, которые позволяют использовать свободную энергию сорбции химически инертных субстратных фрагментов на ферменте на понижение активационного барьера скоростьлимитирующей химической стадии (см. 4 этой главы). Возможно, наличие промежуточных соединений в ферментативных механизмах отражает лишь сложную картину участия в реакции большого числа функциональных групп, многие из которых вообще склонны образовывать ме-тастабильные продукты (как, например, имидазольная группа [29]). Иными словами, образование промежуточных соединений хотя и сопровождает ферментативный катализ, но, возможно, не имеет прямого отношения к наблюдаемым ускорениям. [c.66]

Последующее химическое превращение сорбированной молекулы субстрата Идет через промежуточное образование ковалентного соединения, представляющего собой фермент, ацилированный по активному центру. Некоторые промежуточные ацилферменты были выделены в чистом виде [2, 7], и их образование в процессе гидролиза сложноэфирных субстратов получило подтверждение также спектрофотометриче- [c.128]

Механизм ускорения удалось вскрыть при исследовании температурной зависимости ферментативной реакции [70, 71]. На рис. 35 приведены активационные параметры стадии гидролиза для двух рядов ацилферментов (уравнение 4.6). Из этих данных видно,, что реакции гидролиза ацилхимотрипсинов, содержащих в субстратном остатке ту же самую группу К, протекают с почти одинаковой энтальпией активации. В то же время наличие в субстратном остатке а-ацетиламидной Труппы приводит к выигрышу в энтропии активации порядка 10—12 кал/моль/град (42—50,4 Дж/моль/град). Этот результат показывает, что активный центр выступает в роли энтропийной ловушки субстрата. Иными словами, энтропийный характер ускорения реакции, наблюдаемого в случае специфических субстратов, подтверждает представление о том, что сорбционное взаимодействие между а-ацил- [c.137]

Сравнивая уравнения (4.26) и (4.27), следует заключить, что гидрофобный специфический эффект в химотрипсиновом катализе сильно зависит от геометрии (пространственного строения) субстратной группы R (сравни коэффициенты при л в этих уравнениях). Наглядно это показано на рис. 42, где отложена величина специфического эффекта S от показателя гидрофобности я боковой субстратной группы R. Видно, что в общем случае специфический эффект проявляется при гидролизе лишь тех ацилферментов R—С(0)—Е, которые содержат в субстратном остатке нормальную (неразветвленную) алифатическую или фенилалкильную группу. Из этого следует, что гидрофобная полость в активном центре фермента, взаимодействующая с субстратной группой, представляет собой узкую щель ,в которую способна погрузиться только лишь линейная алифатическая или плоская арилалкильная углеводородная цепь молекулы субстрата. Геометрические свойства этой полости в активном центре не позволяют сорбироваться в ней разветвленным субстратным фрагментам. Во-вторых, наличие оптимума на кривой функции S—л (при п = 6, см. рис. 42, [c.149]

Рис. 43. Свободные энергии образования фермент-субстратного комплекса AGs и ацилфермента Д Gg н свободные энергии активации каталитических стадий ацилирования гидролиза ацилфермента от свободной энергии переноса Д (Зэкстр субстратной группы R из воды в органический растворитель ( -октанол), если в субстрате НСН(ННС0СНз)С(0)0СНз заместитель R

Наглядной иллюстрацией этому положению служат профили свободная энергия — координата реакции (рис. 44). Из рисунка видно, что в случае производного фенилаланина (где Н равно-СеНэСНа) уровень свободной энергии как комплекса Михаэлиса, так и ацилфермента на 3,6 ккал/моль (15,1 кДж/моль) ниже, чем для производного глицина (где Н равно Н). Это значение соответствует как раз свободной энергии переноса фрагмента СвНдСН2 из воды в органический растворитель (см. 4 этой главы). [c.153]

Для более глубокого понимания механизма действия активного центра интересно Сравнить абсолютное значение стандартной свободной энергии образования ацилфермента (в отсутствие гидрофобного субстратного фparмeнta К) с аналогичной характеристикой какой-либо модельной (неферментативной) реакции. Процесс (4.31) представляет собой фактически переэтерификацию субстратной молекулы при участии серинового остатка 8ег-195. Для производного 01у (не содержащего углеводородной боковой группы Н) [c.153]

Механизм ъ инётической специфичности химотрипсина. Размер химически инертного фрагмента К в субстратной молекуле оказывает влияние не только на связывание субстрата ферментом, но, что более удивительно, иа кинетику химических стадий. Скорость как стадии ацилирования (Аг), так и гидролиза промежуточного ацилфермента [см. уравнение (4.28)] возрастает при увеличении гидрофобности фрагмента Н- Количественное описание кинетической специфичности дает уравнение [c.154]

В согласии с механизмом (4.40) субстратоподобный ингибитор действительно вытесняет из активного центра несколько молекул воды, как это было обнаружено при рентгеноструктурном анализе кристаллического химотрипсина [123]. Однако этот механизм не согласуется с данными по влиянию среды на гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие (см. 4 этой главы). Кроме того, механизм (4.40) противоречит тому, что двойной выигрыш свободной энергии экстракции реализуется лишь в переходном состоянии химической реакции [см. уравнение (4.39)], в то время как в комплексе Михаэлиса вклад гидрофобного фермент-субстратного взаимодействия меньше [см. уравнение (4.29)]. Иными словами, в химотрипсиновом катализе не вся потенциальная свободная энергия сорбции, которую предполагает модель (4.40), равная 2АСэкстр, реализуется в виде прочного связывания субстрата с ферментом. Из диаграммы, представленной на рис. 44, видно, что в комплексе Михаэлиса (или ацилферменте) реализуется в виде свободной энергии связывания E-R лишь инкремент свободной энергии сорбции, отражающий перенос субстрата из воды в неводное окружение (в среду белковой глобулы), равный АО кстр [см. также уравнение (4.29)]. Для объяснения этих фактов следует допустить, что гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие идет в две стадии 1) образование фермент-субстратного комплекса протекает по механизму (4.19), который не противоречит данным по солевому эффекту (на их основании он был и предложен), и термодинамические закономерности его согласуются с уравнением (4.29). Этот механизм также предполагает вытеснение нескольких молекул воды из [c.155]

В итоге приходим к выводу, что конформационно-сольватационные изменения в активном центре, осуществляющиеся при (и за счет) сорбции субстрата на ферменте, приближают комплекс Михаэлиса (или, соответственно, ацилфермент), к переходному состоянию химической стадии (см. гл. II, теоретические воззрения Дженкса, Ламри и Эйринга относительно механизма напряжения ). Не исключено, что именно при этом происходит тонкая настройка по отношению друг к другу функциональных групп белка, входящих в составной нуклео-фял активного центра. [c.156]

Ацилирование химотрипсина метиловыми эфирами а - -ацилзаме-щенных-/,-аминокислот. Характеристикой собственной (внутренней) реакционной способности составного нуклеофила активного центра будем считать константу скорости для некоторой модельной реакции, в которой боковые группы субстрата не принимают участия в сорбции на белке. Для того чтобы найти эту величину, проанализируем, как влияет изменение структуры отдельных субстратных фрагментов на общую скорость образорания ацилфермента [c.158]

Гидролиз промежуточного ацилхимотрипсина. Для того чтобы решить вопрос о внутренней реакционной способности ферментного нуклеофила, действующего в ацилферменте, сравним скорость этой псевдо-внутримолекулярной реакции с аналогичной межмолекулярной реакцией. Атакующая группа составного нуклеофила — это молекула воды, эффективная концентрация которой в псевдовнутримолекулярных реакциях вряд ли может превысить, как полагает Дженкс [10], значение 55М, даже если учитывать некоторую степень ориентации молекулы воды при связывании ее в систему с переносом заряда (см. 3 в гл. II). Следовательно, эффективную величину константы скорости второго порядка, которая следует из экспериментальных значений з, можно принять равной к /ЪЪ. [c.164]

Совершенно другую картину имеем в случае специфического ацилфермента. Так, константа скорости ферментативного гидролиза (йз/55) одного из наиболее специфических соединений, Ы-ацетил-1-фенилала-нилхимотрипсина, практически совпадает с константой скорости для щелочного гидролиза метилового эфира Ы-ацетил-1-фенилаланина (см. табл. 30). Можно думать, что щелочной гидролиз более близкой к ацилферменту неферментативной модели, а именно 0-(Ы-ацетил-1-фе-нилаланил)-1 -ацетилсерннамида [c.164]

Реакционная способность молекулы воды, принимающей участие в гидролизе специфического ацилфермента (встроенной в активный центр N-aцeтил-L-фeнилaлaнилxимoтpип инa), близка к реакционной способности гидроксильного иона. Поэтому можно заключить, что в ацилферменте, содержащем специфический субстратный остаток, протон молекулы воды, встроенной в активный центр, смещен в сторону имидазола Н1з-57 практически нацело. [c.164]

Особого внимания заслуживает вывод (см. стр. 163), справедливость которого не ограничена никаким допущением. Напомним, что он непосредственно следует из того, что в случае специфического субстрата (метилового эфира М-ацетил-1-фенилаланина) константы скорости щелочного гидролиза и катализируемого ферментом водного гид-ррлиза (на скоростьлимитирующей стадии, /гз/55) практически совпадают (табл. 30). Поэтому можно считать, что роль химотрипсина как катализатора реакции гидролиза сводится к сорбции на активном центре химически инертных фрагментов субстратной молекулы с последующим использованием сил. сорбции для следующих действий 1) поляризации молекулы воды, встроенной в активный центр ацилфермента настолько, что она полностью депротонирована 2) жесткому закреплению (ориентации) субстратного карбонила по отношению к атакующему нуклеофилу (образовавшемуся гидроксильному иону), чтобы эффективная концентрация последнего достигла предельного для воды значения —55М. 1 [c.166]

Прямое кинетическое подтверждение образования промежуточных соединений и Х2 в катализе гидролиза эфиров N-aцилиpoвaнныx-L-аминокислот получено из анализа кинетики реакции на длинах волн поглощения промежуточных соединений ( 290 нм) [9]. Так, при смешивании раствора а-химртрипсина с метиловым эфиром Ы-ацетил-1-фенилаланина наблюдается быстрое (кинетически неразрешенное) спектральное изменение (по-видимому, образование первичного фермент-субстратного комплекса Х ), за которым следует медленная кинетика образования ацилфермента (рис. 64,а). В стационарной фазе реакции в условиях,, когда расходом субстрата можно пренебречь, концентрация ацилфермента сохраняется постоянной последующий расход субстрата приводит к- исчезновению в растворе промежуточных соединений (рис. 64,6) [9]. [c.198]

Биохимия Том 3 (1980) -- [ c.108 ]

Основы биохимии Т 1,2,3 (1985) -- [ c.254 ]

Основы биологической химии (1970) -- [ c.203 ]

Химия биологически активных природных соединений (1970) -- [ c.228 ]

Структура и механизм действия ферментов (1980) -- [ c.37 , c.113 , c.188 , c.213 , c.227 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология