Триптические ферменты

Белок, содержащий цистин и, следовательно, имеющий дисуль-фидные связи, подвергают ферментативному гидролизу. Следует подобрать такой фермент, который обеспечит получение мелких пептидов, т. е. расщепит цепь во многих точках. Наименее пригоден для этой цели трипсин из-за высокой избирательности действия, а также из-за хорошо известной устойчивости белков, содержащих дисульфидные связи, к триптическому гидролизу. [c.106]

Нативная рибонуклеаза не чувствительна к действию трипсина и химотрипсина. Поэтому сначала проводили окисление рибонуклеазы (остатки цистина при. этом окислялись до остатков цистеиновой кислоты) и окисленный препарат подвергали затем действию протеолитических ферментов. При помош,и хроматографии на дауэкс 50-Х-2 [82] из триптического гидролизата было выделено 15 пептидных фрагментов [82], а из гидролизата после действия химотрипсина — 32 фрагмента [83]. Для количественного определения аминокислотного состава выделенных пептидов и для достижения их чистоты необходимо использовать достаточное количество исходного материала (200 мг). Фракции, содержащие более одного компонента, подвергают повторному фракционированию в несколько измененных условиях. Расщепление с помощью пепсина [6], хотя оно и не столь селективно, позволяет, однако, получить другие пептиды, которые помогают воссоздать полную структуру рибонуклеазы. [c.415]

Химотрипсин — наиболее хорошо изученный протеолитический фермент. Он катализирует гидролитическое расщепление пептидной (или сложноэфирной) связи, в образовании которой принимают участие фенилаланин, тирозин или триптофан. Образование химотрипсина происходит в поджелудочной Железе первоначально образуется неактивный химотрипсиноген (зимоген) — резервная форма фермента. Основной компонент, химотрипсиноген А, представляет собой полипептидную цепь из 245 аминокислотных остатков и 5 дисульфидных мостиков. Активация и образование активного о -химотрипсина осуществляются сложным путем. После триптического расщепления связи Аг -11е последовательно одии за другим из молекулы отщепляются дипептиды 8ег -Аг и ТЬг -А5п . В результате одноцепочечный предшественник переходит в трехцепочечную молекулу фермента. Цепи А, В и С химотрипсина соединены исключительно дисульфидными связями. Рис. 3-32 показывает пространственную модель химотрипсина, установленную на основе рентгеноструктурных данных. [c.408]

Протеолитические ферменты солода могут быть разделены на две группы 1) протеиназы, куда входят протеазы с оптимумом рн 3—4,5, дающие первые продукты распада белков триптические ферменты с оптимумом pH, близким к 6, дающие полипептиды и аминокислоты и 2) пептидазы с оптимумом pH, близким к 7, расщепляющие поли- и дипептиды до аминокислот. [c.105]

Пластеины представляют собой вещества, близкие к белкам. Однако они отличаются от нативных белков по своим физико-химическим свойствам и прежде всего полной нерастворимостью в воде. Работы А. Я- Данилевского о синтезе пластеинов ферментами нашли подтверждение в многочисленных исследованиях В. В. Завьялова, Д. М. Лаврова, Д. И. Кураева, С. С. Салазкина, А. В. Благовещенского и др., показавших, что под влиянием пепсина, трипсина, папаина и других протеолитических ферментов из продуктов пептического или триптического переваривания белка образуются новые, более сложные соединения белкового характера. [c.327]

Исследование отпечатков пальцев белка не дает воз можности сразу же воспроизвести его структурную формулу. Трудность в том, что-, мы не знаем расположения отдельных полипептидов триптического гидролизата вдоль цепи. В дальнейшем будет показано, как с помощью-кинетического эксперимента удается перенумеровать отдельные пептиды и расставить их в должном порядке. Чисто химическим способом этого нельзя сделать, и потому приходится прибегать к получению второго независимого гидролизата того же белка с помощью второго фермента и к изучению второй независимой. гаммы -отпечатков пальцев. [c.30]

Анализ характера триптического переваривания необлученных головок спермы и нитевидного ДНП (слабый протеолиз, отсутствие зависимости от концентрации фермента и времени инкубации, необходимость гомогенизации для выявления переваривания ДНП и т. д.) позволяет предположить, что ход ферментативной реакции в этом случае определяется состоянием и структурой выделяющейся ДНК. [c.88]

На рис. 15 показан результат деления смеси пептидов из триптического гидролизата лизоцима белка яиц на ионообменной смоле дауэкс 50 X 4. Обычно пептиды гидролизатов обозначаются большой буквой Т или X (в зависимости от использованного фермента) и номером. Видно, что ионообменная хроматография позволяет разделить такую сложную смесь (18 пептидов) не до конца. Пептиды, которые выделить в чистом виде не [c.84]

Вопрос о том, одинаковы или различны аминокислотные последовательности субъединиц, можно выяснить путем определения числа пептидов в ферментативном гидролизате белка. Наиболее широко используемый для этой цели протеолитический фермент — трипсин, гидролизующий только те пептидные связи, которые образованы карбоксильными группами лизина или аргинина. По суммарному содержанию лизина и аргинина в белке можно примерно предсказать число триптических пептидов, которые должны образоваться при полном гидролизе трипсином. Для белка, состоящего из одной полипептидной цепи, число триптических пептидов равно числу остатков лизина и аргинина в молекуле плюс 1. Вдвое меньшее число пептидов образуется из белка, содержащего две субъединицы с одинаковой аминокислотной последовательностью. Пептиды разделяют на бумаге или других подходящих носителях (гл. 5), используя обычно электрофорез в одном направлении и хроматографию в другом с последующим обнаружением пептидов по реакции с нингидрином. Чрезвычайно маловероятно, чтобы два триптических пептида с различной аминокислотной последовательностью обнаружились в виде одного пятна. Более серьезные возможные осложнения обусловлены тем, что значительная часть триптических пептидов оказывается нерастворимой и не проявляется на пептидных картах, как это иногда случается при исследовании крупных белков. Обычно же число обнаруживаемых пептидов довольно близко к ожидаемому. Следовательно, метод пептидных карт в сочетании с определением молекулярной массы достаточен для того, чтобы выяснить, являются ли аминокислотные последовательности субъединиц одинаковыми или различными. [c.172]

Другие ферменты, например химотрипсин и пепсин (гл. 7, раздГ.2), менее избирательны, но все же их тоже можно использовать для расщепления пептидной цепи на фрагменты с последующим определением структуры этих фрагментов. Для установления полной аминокислотной последовательности белка нужно найти перекрывающиеся фрагменты, содержащие последовательности, в которые входят концы двух разных триптических фрагментов. Таким путем можно выстроить пептиды в том порядке, в котором они расположены в нативном белке. [c.167]

Нативные белки либо вовсе не атакуются трипсином, либо перевариваются крайне медленно. Не следует забывать также, что при триптическом гидролизе могут образоваться высокомолекулярные нерастворимые структуру, устойчивые к действию фермента, так называемые кор -структуры ( ore). [c.169]

Если провести серию гидролитических расщеплений исследуемого пептида или белка с применением различных ферментов, получается несколько наборов коротких пептидов (так называемых триптических пептидов), последовательность каждого из которых легко устанавливается секвенированием по Эдману. Далее сопоставление последовательностей триптиче-СК11Х пептидов и выявление перекрывающихся фрагментов позволяют реконструировать первичную структуру пептида или белка. [c.59]

Вкратце рассмотрим a +.Mg + ATPaay мембраны саркоплазматического ретикулума, биохимические особенности которой подробно охарактеризованы. Молекула фермента состоит иэ одной полипептидной цепи (AI 100 000), возможно, это протеолипид. Частичное расщепление трипсином показало, что обе функции —гидролиз АТР и транспорт ионов — осуществляются на разных участках одной и той же полипептидной цепи. Фрагмент триптического расщепления с М 30 000 содержит участок, который, как и в Na+,K+-Ha o e, кратковременно фосфорилируется АТР другой фрагмент с М 20 000 может быть встроен в искусственную липидную мембрану с появлением селективной кальциевой проводимости. Возможно, что он представляет собой ионофор [9]. При этом, однако, не выяснен механизм сопряжения энергии гидролиза АТР с ионным транспортом. [c.179]

Каждый из этих ферментов атакует вполне определенные пептидные связи. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, карбонильная группа которых принадлежит одной из основных аминокислот, обычно аргинину или лизину. Пепсин и химотрипсин предпочтительно катализируют гидролиз тех пептидных связей, в образовании которых участвуют ароматические аминокислоты, в частности триптофан, тирозин и фенилаланин. Среди протеолитических ферментов наиболее высокой специфичностью обладает трипсин поэтому именно он наиболее подходит для такого рода анализа. Ясно, однако, что при помощи только одного, пусть даже абсолютно специфичного, фермента невозможно определить полную последовательность аминокислот в полипептиде. Если, например, триптическое расщепление полипептида дало пять фрагментов (пептидов), в сумме соответствующих всей цепи, и если даже для каждого из них удалось установить аминокислотную последовательность, то это еще не все требуется узнать, в каком порядке эти пептиды располагались в нативном полипептиде. Чтобы узнать это, необходимо получить другие пептиды, которые перекрывались бы с первыми. Главное преимущество ферментативного гидролиза — специфичность реакции расщепления в отношении природы расщепляемых пептидных связей накладывает в то же время строгое ограничение на применимость этого метода. В идеале желательно было бы, например, иметь возможность расщеплять иногда те пептидные связи, которые в норме трипсином не атакуются, или, наоборот, предохранять от расщепления связи заведомо чувствительные. Недавно были предложены некоторые модификации методики, которые позволяют в какой-то мере решить эту задачу. Так, например, реакция е-аминогруппы лизина с этилтрифтортиоацетатом в слабо щелочном растворе дает блокированный по аминогруппе остаток, пептидная связь которого не атакуется трипсином [c.90]

Для определения триптического действия панкреатина можно, конечно, вместо молока пользоваться каким-нибудь другим белковым препаратом, в особенности если нужно получить более точные результаты. В таком случае можно применять методы, описанные при трипсине (см. ниже), или итти следующим испытанным путем. Приготовляют раствор казеина, содержание казеина в котором точно определяют весовым путем. Для этого растворяют 100 г казеина (по Н а m m а г s t е п у) в 80 мл 1 н. раствора едкого натра, доведенных водой до 2 литров, если нужно при нагревании, или 100 г казеината натрия (нутрозы) и 0 мл 1 н. раствора едкого натра разбавляют водой т 2 л при нагревании. Для исключения возможного влияния протеолитических ферментов, содержащихся в казеине, раствор его быстро нагревают до 85—90° и дают ему остыть. Для каждого определения употребляют 100 мл этого раствора. Если содержание в нем белка и было установлено заранее при предварительных опытах, то все же лучше каждый раз наряду с определением панкреатина проводить слепой опыт. Для определения в два стакана вносят по 100 мл раствора казеина, нагревают до 38— 40° и прибавляют в один из них 0,1 г мелко растертого и замешанного с 5—10 мл воды панкреатина. В обоих стаканах объем доводят водой до 250 мл, после чего оставляют стоять полчаса при 40° при частом помешивании. Затем содержимое обоих стаканов выливают в два заранее приготовленных стакана, содержащих по 150 мл Ю / -го раствора сульфата натрия, после чего в каждый стакан при непрерывном помешивании приливают тонкой струей 3—4 мл разбавленной серной кислоты (1 4). [c.525]

Важным методом изучения активного центра явилась реакция фосфоглюкомутазы с диизопропилфторфосфатом (ДФФ) — необратимым ингибитором фосфоглюкомутазной реакции. Этот ингибитор присоединяется к гидроксильной группе серина, находящегося в активном центре фермента. Образующееся производное с трудом подвергается гидролизу и после триптического гидролиза фермента фосфори-лированный остаток серина может быть обнаружен в одном из образующихся пептидных фрагментов. Определение последовательности аминокислот такого фрагмента привело к расшифровке структуры активного центра фосфоглюкомутазы, которая оказалась следующей тре — ала — сер — гис — асп —. [c.173]

Аминокислотная последователыность небольших пептидов определялась химическими методами — динитрофенильным, деградацией по Эдма у и гидразинолизом, а также расщеплением карбокоипептидазой. Триптические пептиды большой длины подвергались дальнейшему расщеплению другими протеолитическими ферментами — химотрипсином, пепсином или папаином аминокислотная последовательность полученных меньших пептидов определялась обычными химическими методами (см. кн. L стр. 83). [c.129]

Механизм триптического гидролиза, согласно предложенной схеме, включает последовательную цепочку химических стадий взаимодействия фермента и субстрата, протекающих через ковалентные промежуточные состояния. Каталитический процесс начинается с образования невалентного комплекса Михаэлиса (П), в котором гидроксил Ser-195 и имидазольное кольцо His-57 фермента оказываются сближенными соответственно с карбонильной и амидной группами расщепляемой пептидной или сложноэфирной связи субстрата. В результате их согласованных взаимодействий невалентное фермент-субстратное связывание переходит в ковалентное с образованием сначала малоустойчивого промежуточного соединения так называемого тетраэдрического аддукта (III). Последний распадается на ацилфермент и амин (IV), а при гидролизе сложного эфира на ацилфермент и спирт. Далее следует деацилирование, которое проходит в принципе аналогичным образом, но в обратном порядке и с участием в качестве нуклеофильного агента не атома О боковой цепи Ser-195, а молекулы воды. Вновь образуется метастабильный тетраэдрический аддукт (V), [c.150]

Причиной неспецифичности расщепления данным ферментом может быть наличие в нем примесе других протеаз. Например, трипсин может содержать примесь химотрипсина, от которой освобождаются с помощью аффинной хроматографии, а триптическая активность в химотрипсинс подавляется добавлением ингибитора трипсина перед проведением гидролиза. [c.350]

В результате ограниченного трипсинолиза фермента из скелетной и сердечной мышц (рис. 19) образуются крупные фрагменты с кажущимися молекулярными массами около 55 и 45 кД (расщепление в участке Т, фрагменты А и В соответственно). Более длительная обработка фермента трипсином приводит к появлению фрагментов с кажущимися молекулярными массами 30 и 20 кД (фрагменты А и Лг соответственно, расщепление в участке Tz). На основе данных об аминокислотной последовательности фермента истинные молекулярные массы фрагментов составляют 55, 54, 33 и 20 кД. Фосфорилированный под действием [у- Р] АТФ интермедиат АТФазы оказывается локализованным в Л-фрагменте и его триптическом производном Л 1-фрагменте (рис. 19). [c.62]

Работа по проверке взаимного расположения функционально важных доменов АТФазы осуществляется в нескольких направлениях. Так, на основании результатов Д. МакЛеннана и сотрудников (1986) (рис. 22) функциональные центры АТФазы локализованы на различных триптических фрагментах фермента и отделены друг от друга десятками и сотнями аминокислотных остатков однако, входя в состав активного центра, они должны быть пространственно близки. Эта близость может обеспечиваться наличием петель полипептидной цепи в цитоплазматическом домене фермента. [c.67]

Действительно, под действием бифункциональных агентов удается сшить различные функциональные и структурные домены фермента дополнительно через остатки лизина (лиз-352 на А-фрагменте и лиз-514, участвующий в связывании АТФ и локализованный на Л-фрагменте). После триптического расщепления АТФазы возникали фрагменты с молекулярными массами 22 и 88кД (D. С. Ross, D. В. M lntosh, 1987). При таком точечном воздействии на фермент его каталитическая активность полностью блокировалась. На основании этих данных можно заключить, что функционально важные аминокислотные остатки, расположенные на различных доменах, прост- [c.67]

Можно ЛИ, зная первичную последовательность фермента, предсказать не только взаимное расположение его отдельных функционально важных участков, но и структуру каждого из них Такая попытка сделана в 1986 г. в лаборатории А. Е. Шаму для участка связывания, обладающего высоким сродством к Са + При внимательном рассмотрении аминокислотной последовательности фермента обнаруживается, что в цепи из восьми аминокислот, примыкающих ко второму (Гг) участку триптического гидролиза (рис. 22), содержатся три остатка пролина, близко расположенных друг от друга (отделены одной аминокислотой). Как известно, именно пролин обеспечивает изгиб полипептидной цепи. Эта цепь из восьми аминокислот может образовать структуру почти круговой конфигурации. Важно также, что данная последовательность содержит остатки глутаминовой и аспарагиновой (в случае фермента из быстрой мышцы) или двух аспарагиновых (фермент из сердца или [c.69]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология