Галактозидаза структура

Возвращаемся теперь к конститутивным штаммам. Можно думать, что мутация в локусе i затрагивает строение белка. Но это не так. Разнообразными экспериментами показано, что ферменты, синтезируемые индуцируемым и конститутивным штаммами, абсолютно идентичны. Они ведут себя одинаково нри хроматографии, электрофорезе, иммунологических реакциях и обладают одинаковыми константами Михаэлиса, характеризующими их каталитические свойства. Следовательно, цистрон i не имеет отношения к структуре белка Р-галактозидазы, но управляет количеством синтезируемого клеткой фермента. Ясно, что цистрон [c.487]

Индуцирование синтеза р-галактозидазы было изучено Моно с сотрудниками (1959), и они получили следующие важные результаты. Во-первых, кроме лактозы, индуцирующее действие оказывали также и некоторые другие вещества. Все эти вещества — индукторы по структуре — были похожи на лактозу, но не все являлись субстратами для р-галактозидазы. Некоторые из них не обладали измеримым сродством к ферменту. Вероятно, индуктор воздействует на молекулу фермента не прямо. Добавление индуктора к растущей бактериальной культуре приводит к синтезу р-галактозидазы и, таким образом, индуктор оказывает влияние на синтез фермента. [c.237]

Минимальный эффективный размер оператора, с которым может связаться молекула La -репрессора, составляет 17 пар оснований (выделены жирным шрифтом). В каждый данный момент времени с оператором связаны две субъединицы репрессора. Внутри последовательности в 17 пар оснований по крайней мере одно основание каждой пары принимает участие в узнавании и связывании репрессора. Связывание происходит в основном в большой бороздке ДНК без нарушения нормальной двухспиральной структуры области оператора. Участок молекулы репрессора, включающий первые 52 аминокислотных остатка, связывается с ДНК, не проявляя, судя по всему, специфичности к какой-то определенной последовательности. Другая область репрессора (остатки с 53 по 58) строго специфично связывается с 17-звенным фрагментом операторной области протяженностью 6—7 нм. Аминокислотные остатки в положении 74—75 особенно важны для связывания индуктора с молекулой репрессора. Операторный локус находится между промотором, к которому перед началом транскрипции присоединяется ДНК-зависимая РНК-полимераза, и началом гена Z— структурного гена 3-галактозидазы (рис. 41.3). Присоединившись к оператору, репрессор препятствует транскрипции операторного локуса и дистальных структурных генов Z, Y vi А. Таким образом, репрессор является негативным регулятором в его присутствии подавляется экспрессия Z, У и Л-генов. Обычно на клетку приходится 20—40 тетрамерных молекул репрессора и 1—2 операторных локуса. [c.113]

Структура Р-галактозидазы. Включить данный фермент в раздел, посвященный ДНК-связывающим белкам, но не принадлежащий, строго говоря, к таковым, побудили следующие два обстоятельства [c.117]

Мутации гена регулятора у мутантов р-галактозидаза по структуре не отличается от исходной родительской формы, по синтезируется либо слишком много, либо слишком мало фермента, или синтез фермента осуществляется в отсутствие индуктора, или наоборот — фермент не синтезируется и в присутствии индуктора. [c.50]

Рис. 8-8. Структура высокомолекулярного флуорогенного субстрата -галактозидазы.

В общем случае значение а — это характеристика сорбционной способности активного центра данного фермента. Если а <С 1 (как, например, в рассмотренном катализе (3-галактозидазой), то субстратная группа К, по-видимому, либо погружаетгя (переносится из воды) в органическую среду белка не полностью, либо связывание ее требует термодинамически невыгодных затрат на конформационное изменение структуры того или другого реагента. Гидрофобное ферментсубстрат-ное взаимодействие может быть термодинамически более выгодным, чем это предполагает простая экстракционная модель (где а= 1). В этом случае активный центр должен содержать локальный участок с относительно невыгодной поверхностной энергией пограничного слоя белок — растворитель например, с гидрофобными боковыми группами [c.44]

То, что сворачивание полипептида в белок происходит в процессе синтеза на рибосоме, т. е. ко-трансляционно, следует из целого ряда косвенных свидетельств. Одно из них— приобретение растущим пептидом на рибосоме активностей, присущих готовому белку со сформированной третичной структурой. Давно известный пример — синтез Р -галактозидазы ферментативная активность этого белка требует не только сворачивания полипептидной цепи в третичную структуру, но и объединения четырех субъединиц в четвертичную структуру оказалось, что растущая цепь до своего завершения, будучи присоединенной к рибосоме, уже способна ассоциировать со свободными субъединицами белка, и комплекс на рибосоме проявляет Р-галактозидазную активность. [c.273]

Еще более убедительны опыты, демонстрирующие приобретение растущим пептидом на рибосоме иммунологической специфичности, присущей нативной конформации готового белка. Так, рибосомы, несущие растущие цепи р-галактозидазы, реагируют с антителами против готового фермента еще задолго до завершения трансляции мРНК и освобождения белка. Используемые антитела были специфичны к третичной структуре денатурация рибосомосвязанного материала путем нагревания полностью разрушала его способность реагировать с антителами. [c.273]

Другой пример сильного взаимодействия белка с ДНК—регуляция оперона белком-репрессором. Наиболее изученным примером является 1ас-оперон Е. соИ [25]. Ген-регулятор кодирует синтез белка 1ас-репрессора, который затем связывается с соседним оператором. Связывание с белком-репрессором малой молекулы— индуктора, например изопропилтио-р- )-галактопиранозида, вызывает диссоциацию репрессора с операторного участка. Последующая транскрипция трех соседних генов оперона приводит к биосинтезу трех ферментов — Р-галактозидазы, галактозопермеазы и тиогалактозидтрансацетилазы. 1ас-Репрессор представляет собой тетрамерный белок, состоящий из идентичных субъединиц по 347 аминокислот каждая. Сродство репрессора к последовательности ДНК оператора зависит от ионной силы константа диссоциации в клетке, вероятно, менее 10 " моль/л . Структура участка связывания ДНК в 1ас-репрессоре до сих пор не выяснена, однако удаление трипсином 59 остатков с Л -конца и 20 остатков с С-конца предотвращает связывание. Несколько больше известно об участке связывания индуктора. Измерения флуоресценции показывают, что находящийся в участке связывания индуктора остаток триптофана при связывании перемещается в менее полярное окружение. Изучение изменения флуоресценции методом остановленного потока показывает, что процесс связывания проходит в две стадии. Быстрая начальная стадия подчиняется, как и ожидалось, кинетике второго порядка. Более медленная стадия мономолекулярна и, по- [c.569]

Следует учитывать, что микробиология дольше всего оставалась цитаделью ламаркизма, и идея о направленных изменениях клетки в ней долгое время долшнировала. Однако точный эксперимент полностью опроверг все идеи об адаптивном синтезе. Оказалось, что если клетка способна образовывать данный фермент, например р-галактозидазу, то фермент образуется всегда, но в относительно малых количествах. На современном языке это означает, что в клетке содержится вся необходимая информация для синтеза соответствующего активного белка, или иначе — в хромосоме имеется цистрон, где зафиксирована химическая структура ферментного белка. Однако в силу каких-то причин, например действия подавителя, синтез р-галактозидазы идет медленно и только под действием субстрата, т. е. лактозы, он резко изменяет темп. [c.481]

Рекомбинанты с измененной антигенной структурой становятся чувствительными к одному из фагов Shigella [340], а также к фагам, которые не действовали на исходные клетки [576]. Если же рекомбинанты не подвергаются антигенным изменениям, они сохраняют восприимчивость к фагам, как и исходные клетки. В большинстве случаев не наблюдалось также изменений ферментационных способностей рекомбинантов по сравнению с родительскими штаммами [340]. Исследовалась наследуемость способности синтеза бета-галактозидазы среди рекомбинантов этих типов [486]. [c.52]

Определение химической структуры белка следует начинать с количественного анализа аминокислотного состава его полипептидных цепей. Для этого чистый и, если это возможно, кристаллический белок подпер-гают обычно кислотному гидролизу, чтобы гидролизовать все имеющиеся в белке пептидные связи, которые соединяют аминокислоты, входящие в состав этого белка. Затем определяют относительные количества высвобождающихся при таком гидролизе двадцати стандартных аминокислот. Определение количества аминокислот проводят с помощью метода хроматографии на ионообменных смолах, разработанного в начале 50-х годов У. Штейном и С. Муром (фиг. 39, 40). Результаты такого анализа аминокислотного состава двух ферментов Е. oli (Р-галактозидазы и триптофан-синтазы) приведены в табл. 2. (Триптофан-синтаза Е. соН, как скоро будет показано, состоит из двух различных полипептидных цепей, названных А-белком и В-белком. Данные, приведенные в табл. 2, касаются только А-белка.) [c.83]

К сожалению, метод с использованием динитрофторбензола применим ТОЛЬКО для определения нескольких первых от Н-конца аминокпслот. Для более отдаленных от конца аминокислот (начиная с шестой или седьмой аминокислоты от Н-конца) результаты анализа становятся настолько неоднозначнымн, что уже нельзя сделать надежного заключения о действительной структуре полипептида. Поэтому описанный метод можно использовать для определения последовательности аминокислот лишь в коротких полипептидах, состоящих из четырех или пяти аминокислотных остатков. Следовательно, для непосредственного анализа А- и В-це-пей инсулина длиной в 21 и 30 аминокислот этот метод неприменим, не говоря уже о последовательностях таких белков, как Р-галактозидаза и триптофан-синтаза, состоящих из сотен аминокислотных остатков. [c.89]

Специфичность, которую проявляет фермент в отношении субстрата как при образовании комплекса, так и при каталитическом химическом превращении, обусловлена существованием на поверхности фермента специфического участка. Этот участок фермента называется его активным центром. Исходя из размера молекулы субстрата, которая узнается активным центром, например молекулы лактозы, можно подсчитать, что активный центр соответствует участку примерно в400А . Таким образом, активный центр составляет лишь небольшую часть всей поверхности фермента. Многие ферменты, особенно те, которые состоят из одной лишь полипептидной цепи, обладают только одним активным центром. Однако молекула р-галактозидазы имеет четыре активных центра — по одному на каждую из четырех идентичных полипептидных цепей, участвующих в образовании ее четвертичной структуры. Подробная молекулярная картина активного центра была получена впервые в 1964 г., когда был проведен рентгеноструктурный анализ третичной структуры кристаллического фермент-субстратного комплекса. Полученные результаты показали, что субстрат располагается в небольшом углублении на поверхности фермента и окружен примерно 20 аминокислотами полипептидной цепи. Именно эта группа аминокислот и входит в состав активного центра, а боковые цепи этих аминокислот образуют с субстратом слабые химические связи. Сродство фермента к субстрату отражает образование этих связей. Следует, однако, отметить, что аминокислоты, составляющие активный центр, расположены на полипептидной цепи отнюдь не рядом. Наоборот, они очень отдалены друг от друга в первичной структуре и сближаются только в результате образующих третичную структуру искривлений полипептидной цепи. Таким образом, наличие активного центра —это следствие трехмерной конформации фермента. Специфическое узнавание субстрата активным центром обусловлено природой и точным пространственным положением боковых цепей, составляющих активный центр аминокислот. Аминокислоты, входящие в состав активного центра, образуют приемник , форма которого хорошо приспособлена к идеальному субстрату и обеспечивает возможность образования слабых химических связей между ферментом и субстратом. [c.105]

Существование внутригенной комплементации на самом деле не снижает основной ценности определения гена, данного Бензером. Ее легко объяснить, исходя из представления о четвертичной структуре белков. Как мы уже видели в гл. IV, многие белки осуществляют свою биологическую функцию лишь в том случае, если они находятся не в виде отдельной полипептидной цепи, а в составе четвертичной структуры, образованной из двух или большего числа полипептидных цепей. Так, мы уже упоминали, что Р-галактозидаза представляет собой агрегат, состоящий нз четырех идентичных полипептидных цепей. Рассмотрим теперь /5-мутацию в гене, определяющем белок, который проявляет свою ката-.литическую активность, лишь находясь в форме комплекса, построенного из четырех идентичных полипептидных цепей. В этом случае мутантный фенотип 1з, очевидно, возникает в результате появления в одном из участков мутантной полипептидной цепи неподходящей аминокислоты. Вследствие этого интервал температур, в котором агрегат, состоящий из четырех цепей, может принимать физиологически активную четвертичную структуру, оказывается суженным. Это значит, что, хотя при пермиссив-ной температуре 25 °С такой агрегат сохраняет свою активность, при 42 °С он денатурирует. Допустим теперь, что в одной и той же клетке присутствуют две копии гена, определяющего рассматриваемый белок, и, как в цис-транс-тесте, эти копии несут разные мутации. Тогда должны возникнуть гибридные агрегаты мутантного белка, из четырех полипептидов которого часть синтезирована под контролем одного, а часть — под контролем другого /5-мутантного гена. В этом случае существует возможность, что интервал температур, в котором гибридный мутантный агрегат образует функционально активную структуру, окажется шире интервала температур для образования функционально активных агрегатов, состоящих только из одного типа мутантных полипептидов. Это значит, что два разных замещения аминокислот в первичной структуре белка, вызванные двумя й-мутациями, могут привести к взаимной компенсации. В результате такой компенсации агрегат из мутантных полипептидов, так же как и белок дикого типа, сохраняет стабильность в широком интервале температур. [c.314]

Рис. 4.5. Структура. шкерного участка, соединяющего проинсулиновые домены в гибридном белке, состоящем из -галактозидазы и множественных тандемных копий проинсулина [25].

Аналог лактозы, способный индуцировать экспрессию Ьас-оперона и не являющийся в то же время истинным субстратом Р-галактозидазы, можно назвать нерасходуемым индуктором. Добавление лактозы или нерасходуемого индуктора к культуре бактерий, выращиваемой на плохо утилизируемом источнике углерода (например, сукцинате), вызывает незамедлительную индукцию ферментов La -onepoHa. Небольшие количества лактозы или индуктора способны проникать в бактериальную клетку и в отсутствие пермеазы. Молекулы репрессора, как связанные с операторным локусом, так и находящиеся в свободном виде в цитоплазме, обладают сродством к молекулам индуктора. Связывание индуктора с молекулой репрессора, прикрепленной к операторному локусу, вызывает конформа-ционные изменения структуры репрессора и приводит к диссоциации комплекса с ДНК. Если к этому моменту ДНК-зависимая РНК-полимераза уже связана с кодирующей цепью в промоторной области, то начинается транскрипция. Образующаяся при этом полицистронная мРНК имеет на 5 -конце последова-тельнос ть, комплементарную кодирующей цепи оператора. Таким образом, индуктор дерепрессирует La -onepoH и обеспечивает возможность транскрипции структурных генов Р-галактозидазы, галакто- [c.113]

Любая биологически целенаправленная активация ДНК происходит только под воздействием белков и при их непременном участии на всех стадиях последующего процесса. Проявление функциональных свойств ДНК немыслимо без участия множества различных так называемых ДНК-связывающих белков. В эукариотических клетках они традиционно подразделяются на две группы - гистоновые белки, участвующие в создании определенной структуры ДНК внутри клеточного ядра, и не-гистоновые белки, обеспечивающие биосинтез РНК. Ниже рассматриваются результаты рентгеноструктурного анализа гистонов и -галактозидазы, представителей обеих групп ДНК-связывающих белков. [c.109]

Трехмерная структура -галактозидазы Е. oli с разрешением 2,5 А была недавно исследована Р. Джекобсоном и соавт. [435]. Рентгеноструктурный анализ показал, что аминокислотная последовательность белка из 1023 остатков имеет N-концевой а-пептидный участок 1-51 вытянутой формы и пять структурно автономных доменов 51-217 (I), 220-334 (II), 334-627 (III), 627-736 (IV) и 736-1023 (V). В отличие от ДНК-топоизомеразы типа I, где полипептидная цепь переходит от одного незавершенного домена к другому и, не закончив его построения, направляется к третьему и т.д. (рис. 1.30), у -галактозидазы цепь проходит от N-конца молекулы к ее С-концу через все домены строго последовательно. Тем самым облегчается сборка длинной полипептидной цепи белка, поскольку при модульной структурной организации нативного фермента каждый домен может действовать как независимая свертывающаяся субъединица. [c.119]

Ферментативную активность проявляет четвертичная структура -галактозидазы в виде гомотетрамерного невалентного комплекса молекулярной массы 465,412 к Да. Кристаллографический анализ показал, что он принадлежит к точечной группе симметрии 222. Четыре тетрамера составляют асимметричную элементарную ячейку пространственной группы P2i с параметрами a =107,9A, Ь = 207,5 А, с = 509,9 A и = 94,7°. На сегодняшний день из всех идентифицированных на атомном уровне трехмерных структур белков структура молекулы -галактозидазы обладает самой длинной полипептидной цепью. Работа Джекобсона и соавт. [435] впервые продемонстрировала возможность исследования невирусных кристаллов белка с размерами элементарной ячейки, превышающими 500 A, и относительной молекулярной массой 2000 кДа на асимметрическую единицу. [c.119]

Мутации структурного гена у мутаптов структура Р-галактозидазы отличается от структуры родительского фермента, т. е. имеются различия в аминокислотной последовательности. [c.50]

Эти мутантные гены были локализованы в хромосоме Е. соИ. У мутантов первой группы изменения захватывают один ген, называемый Z-геном. Это структурный ген для р-галактозидазы, т. е.. с этого гена транскрибируется мРНК, которая транслируется в фермент. У мутантов второй группы изменения захватывают два разных гена. Один из них расположен рядом с Z и называется 0-геном. Другой — на небольшом расстоянии от первого и называется -геном. Оба эти гена (г и О) регуляторные, т. е. они не ВЛИЯЮ1 на структуру белка, а только определяют,- будет ли вообще синтезироваться белок и с какой скоростью. [c.51]

Изменение способности олеатдесатуразы вводить в субстрат двойные связи на способность осуществлять его гидроксилирование на основании сравнения первичной структуры исходного фермента и неродственных гидроксилаз потребовало замены с помощью направленного мутагенеза семи а.о. [335] Десятикратное возрастание активности фукозидазы и 40-кратное уменьшение активности -галактозидазы в результате изменения шести а.о. [315] [c.457]

Смотреть страницы где упоминается термин Галактозидаза структура: [c.203] [c.248] [c.587] [c.437] [c.480] [c.8] [c.322] [c.483] [c.485] [c.99] [c.478] [c.480] [c.71] [c.267] [c.178] [c.139] [c.131] [c.407] [c.302] [c.308] [c.18] [c.248] [c.320] [c.53] [c.210]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология