Саузерн-гибридизация с РНК-зондами

Рис. 20.11. Использование рестрикционных сайтов в качестве генетических маркеров. А. Замена одной пары нуклеотидов в рестрикционном сайте приводит к тому, что рестриктаза не распознает его и не расщепляет ДНК. Интактный и измененный сайты рестрикции отмечены знаками (+) и (—) соответственно. Б. Участок одной хромосомы, содержащий три сайта (А, 1 и В), узнаваемые одной и той же рестриктазой. X - расстояние между сайтами А и 1, У - расстояние между сайтами 1 и В, X + У -расстояние между сайтами А и В. Сайты А и В во всех случаях интактны (оба +), а сайт 1 может быть как интактным (+), так и измененным (-). Если сайт 1 интактен (+), то после обработки ДНК рестриктазой образуются фрагменты X и У. Если же он изменен (—), то образуется единственный фрагмент (X + V). Если провести блот-гибридизацию по Саузерну с зондом а, то мы обнаружим фрагмент X в том случае, если сайт 1 интактен (+), и фрагмент (X + V), если он изменен (-). В. Фрагменты, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации по Саузерну с зондом а, для каждого из генотипов (+/+, +/-, -/-). Г. Фрагменты одной хромосомы, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации с зондом Р или у.

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают [c.65]

Прогулка по хромосоме -это инструмент, позволяющий систематически картировать хромосомы эукариотических организмов. Обсуждав-щиеся в этой главе методы работы с ДНК-клонирование рестрикционных фрагментов, анализ сайтов рестрикции в клонируемой ДНК, метод Саузерна, использование клонируемой ДНК в качестве радиоактивного зонда при гибридизации с другими фрагментами ДНК-дают возможность использовать мощные методы генетического анализа, разработанные на прокариотических организмах, для исследования генетической организации эукариот на уровне нуклеотидных последовательностей. Применение этих методов привело к колоссальному прогрессу в нащих знаниях об организации, функционировании и эволюции геномов эукариот. Некоторые из этих открытий мы подробно обсудим в следующих главах, о других можно прочитать в научных журналах. [c.288]

Анализ набора фрагментов ДНК с помощью электрофореза в геле, переноса по Саузерну и гибридизации с радиоактивными зондами 1 и 2 [c.221]

Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое количество ДНК. Дополнительные затруднения связаны также с возможностью перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши. Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят радиоактивными изотопами (такими, как Р или Н) с помощью ник-трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК. Как показано на рис. 18.17, эти препараты ДНК [c.308]

В этом разделе рассматриваются основные методы использования РНК-зондов при исследовании нуклеиновых кислот в обычной лабораторной практике. В раздел включены детальные описания методов, в которых РНК используются вместо ДНК-зондов при Саузерн- и нозерн- гибридизации и в опытах по защите от действия РНКазы. [c.27]

Рестриктаза. Эндонуклеаза, расщепляющая обе цепи ДНК в строго определенных сайтах со специфической последовательностью оснований. Саузерн-блоттинг. Метод переноса фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр с последующей гибридизацией с меченым зондом. Сигнал. Конечный этап визуализации определенного фрагмента ДНК (клона). Например, при радиоавтографии—темное пятно на рентгеновской пленке, соответствующее месту нахождения гибридного дуплекса, одна из цепей которого является радиоактивно меченным зондом. [c.51]

Первым шагом является расщепление геномной ДНК рестрикционной эндонуклеазой. К настоящему времени обнаружено около 90 рестрикционных эндонуклеаз. Все они разрезают ДНК по определенным сайтам в нуклеотидной цепи ДНК, в результате чего получаются фрагменты воспроизводимого размера. Затем пробу расщепленной ДНК (обычно 5 или 10 мкг) помещают в лунку в 0,8%-ном агарозном геле и подвергают горизонтальному гель-электрофорезу. Отрицательно заряженные фрагменты ДНК мигрируют к аноду со скоростью, соответствующей их размеру,- самые маленькие фрагменты путешествуют дольше всего. Гель пропитывают раствором бромистого этидия, при этом фрагменты ДНК становятся видимыми и их можно сфотографировать в ультрафиолетовом свете. Затем, чтобы получить одноцепочечные фрагменты ДНК, гель пропитывают щелочью. После нейтрализации в сильном буферном растворе гель приводят в контакт с нитроцеллюлозным или найлоновым фильтром, чтобы перенести на последний фрагменты ДНК. При этом фильтр кладут на гель и покрывают сухой бумажной салфеткой, на которую переходят фрагменты ДНК из геля в том же порядке, в каком они мигрировали в геле. Фрагменты фиксируют на фильтре, высушивая его (если использовали нитроцеллюлозный фильтр), после чего фильтр (с пятнами Саузерна) готов к гибридизации с содержащим радиоактивную метку ДНК-зондом. [c.69]

Блот-гибридизация по Саузерну — идентификация участка ДНК, содержащего искомую нуклеотидную последовательность, путём гибридизации разделённых гель-электрофорезом и фиксированных на твёрдом матриксе фрагментов ДНК с меченым комплементарным ДНК-зондом. [c.351]

Использование РНК-зондов в блот-гибридизации по Саузерну, по-видимому, увеличивает чувствительность метода — главным образом из-за отсутствия конкурентной гибридизации зонда на себя , препятствующей гибридизации зонд—мищень (такая же чувствительность может быть достигнута и при использовании кДНК или других одноцепочечных ДНК-зондов но такие зонды, как правило, сложнее получить). [c.29]

С целью выделения специфического зонда для прогулки вдоль хромосомы идентифицируют рестрикционный фрагмент, находящийся на конце вставки эукариотической ДНК. Такой фрагмент не должен содержать повторяющихся последовательностей ДНК- Это легко проверить путем гибридизации с суммарной ДНК мыши, используемой в качестве зонда для гибридизации по Саузерну. Этот зонд содержит космидную ДНК, гидролизованную различными ферментами (использованными для картирования). В нормальных условиях будут гибридизоваться лишь те рестрикционные фрагменты, которые содержат повторяющиеся последовательности ДНК (Steinmetz et al., 1980). Фрагменты, которые не гибридизуются и которые происходят из концевых областей вставки эукариотической ДНК, далее выделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, используя один из многочисленных имеющихся методов (Maniatis et al.. [c.34]

Если расстояния от сайта А до сайта 1 и от сайта 1 до сайта В не совпадают, каждое из них не превышает 20 т. п. н. и существует одноко-пийный зонд, гибридизующийся с участком ДНК между сайтами А и 1 (рис. 20.11, Б), то после блот-гибридизации по Саузерну и разделения в агарозном геле фрагментов ДНК, полученных в результате обработки ЯшёПТ, мы сможем различить две ситуации. Первая - сайт 1 расщепляется, в результате чего образуется два фрагмента, и зонд гибридизуется с тем из них, который ограничивается сайтами А и 1. Вторая - сайт 1 не расщепляется и зогщ гибридизуется с фрагментом ДНК, ограниченным сайтами А и В (рис. 20.11, Б). [c.453]

Саузерн-блотгипг (Southern blotting) Обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей путем переноса денатурированных молекул ДНК, подвергнутых электрофорезу, с агарозного геля на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр за счет капиллярного эффекта и гибридизации с меченым зондом, комплементарным искомой последовательности. [c.559]

Рестрикционный анализ ДНК позволяет выявить различия в отдельных нуклеотидных парах, появляющиеся в результате мутаций в сайтах, узнаваемых соответствующим ферментом. В случае серповидноклеточной анемии происходит замена АТ на ТА в шестой паре нуклеотидов гена, кодирующего Р-цепь гемоглобина человека замена происходит в сайте (СТКАО), чувствительном к рестриктазе Ойе (рис. 9.19). Фрагменты ДНК, возникающие под действием Ос1е1 у здорового человека и больного серповидноклеточной анемией можно сравнить с помощью метода гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда радиоактивно меченную ДНК гена Р-глобина, как это показано на рис. 9.19. Таким способом можно определять присутствие вредного мутантного гена в геноме эмбриона за несколько месяцев до рождения. Для этого культивируют зародышевые клетки, взятые при амниоцентезе. ДНК этих клеток экстрагируют и подвергают анализу. Такая диагностическая процедура может производиться в тех случаях, когда существует подозрение, что оба родителя-носители вредного рецессивного гена. Следует заметить, что в большинстве случаев вредные мутации происходят вне сайтов, узнаваемых рестриктазами. Однако иногда такие мутации оказываются в хромосомах тесно сцепленными с сайтами рестрикции, что может во многих случаях использоваться в пренатальной диагностике. [c.288]

Рис. 18.17. Картирование клонированных генов человека при использовании гибридов соматических клеток мыши и человека с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, служащие маркерами данных хромосом, выявляются с помощью гель-электрофореза. Рестрикционные фрагменты ДНК, выделенной из гибридной линии, разделяют электрофорезом в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре проводят их гибридизацию с зондом, меченным радиоактивными изотопами. (По Shows ТВ. et al, 1982. Adv. Hum. Genet., 12, 341-452.)

ДНК-зонды, содержащие последовательности искомых генов, дают возможность идентифицировать эти гены, даже если они и не экспрессируются. Это можно сделать с помощью таких методов, как гибридизация в растворе (достаточно устаревший подход), гибридизация по Саузерну и гибридизация in situ. [c.291]

Рис. 4-72. Методы Нозерн - и Саузерн -блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона ( блоттинг ). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, гак что радиоактивно меченными оказываются лищь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе,

Для анализа структуры гена альбумина дефектных мыщей был использован метод Саузерн-блоттинга. В данном случае вместо РНК анализируется ДНК Изолированную ДНК сначала обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, затем полученные фрагменты разделяют по размеру гель-электрофорезом и выявляют комплементарные ДНК-зонду альбумина с помощью переноса и гибридизации, как это описано для РНК (см. рис. 4-72). Повторяя эту процедуру с различными рестрицирующими нуклеазами, можно получить детальную рестрикционную карту генома в участке альбуминового гена (см. разд. 4.6.2). Анализируя эту карту, можно ответить на вопрос, несет ли альбуминовый ген у дефектных животных перестройки, например, делеции или инсерции коротких фрагментов ДНК. [c.240]

Существенной областью применения ДНК-олигонуклеотидов является дородовая (пренатальная) лиагностика наследственных заболеваний. Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарущением какого-то одного гена. В больщинстве случаев эти мутации рецессивны. Это означает, что болезнь развивается, если человек получает дефектные копии гена сразу от обоих родителей Одна из задач современной медицины состоит в том, чтобы выявлять такие аномальные эмбрионы до рождения, информировать об этом мать и дать ей возможность прекратить беременность. Например, для серповидноклеточной анемии известна точная нуклеотидная замена в мутантном гене (последовательность GAG заменена на GTG в пени ДНК. кодирующей Р-пепь гемоглобина) В данном случае синтезируют два олигонуклеотида Один из них соответствует последовательности нормального гена в участке предполагаемых мутаций, другой несет замену, обусловливающую болезнь. В условиях когда эти последовательности достаточно коротки (примерно 20 нуклеотидов) и при температуре гибридизации, при которой стабильность сохраняют лищь точно совпадающие цепи, можно использовать радиоактивные зонды. Тест состоит в том, что из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости (ее получают в ходе процедуры, называемой амниоцентезом), выделяют ДНК и используют ее для Саузерн-блоттигна с радиоактивными ДНК-зондами. Дефектный эмбрион легко опознается, поскольку его ДНК будет гибридизоваться только с олигонуклеотидом, комплементарным мутантной последовательности ДНК. К сожалению, для больщинства наследственных болезней дефект на уровне ДНК еще не расшифрован, однако круг заболеваний, для которых применяется дородовая диагностика, постоянно расширяется. Это стало возможно благодаря использованию феномена полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В данном случае с помощью гибридизации выявляют наличие или отсутствие определенных сайтов рестрикции, тесно сцепленных с дефектными генами. [c.241]

Затем выявляли фрагменты, в которых имелись носледовательности, кодирующие С-область L-цепи, и фрагменты с кодом для определенной V-области L-цепи (для этого исиользовали гибридизацию но Саузерну с двумя радиоактивными ДНК-зондами один из них был комплемеитареи кодирующей последовательности для V-области, а другой - для С-области мРНК для снецифической L-цепи миеломы) (разд. 18.3). В ДНК клеток миеломы последовательности, кодирующие С - и V-области, были обнаружены в составе одних и тех же фрагментов ДНК, тогда как в ДНК из эмбриона они оказались в разных фрагментах (так же как и в ДНК из другой миеломной опухоли, вырабатывавшей другую L-цепь на схеме не [c.244]

Количество копий специфической последовательности ДНК можно оценить с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Приготовление ДНК из культивируемых клеток описано в гл. 6 книги II данной серии [34], а техника переноса на иитроцеллю-лозный фильтр и гибридизации с клонированным зондом хорошо изложены в работе [27], и в данной главе мы не будем возвращаться к ним. Общая постановка эксперимента показана на рис. 8.8, [c.262]

Типы полиморфизма ДНК. Наиболее распространенный тип полиморфизма ДНК-рестрикционный полиморфизм. Если в сайте узнавания для какой-то рестриктазы происходит точечная мутация, фермент не распознает свой сайт и не разрезает ДНК (рис. 2.84). Имея под рукой специфические ДНК-зонды и рестриктазы, можно анализировать ДНК. Рестрикционные фрагменты ДНК (рестрикты) различаются по длине (полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов). Они идентифицируются по различной подвижности после гибридизации по Саузерну (рис. 6.5). В настоящее время метод гибридизации по Саузерну включает радиоактивное мечение. Вероятно, в будущем появится возможность нерадиоактивного мечения фрагментов ДНК. Точечные мутации, заменяющие один нуклеотид на другой в некодирующем районе ДНК, встречаются очень часто. Немногие систематические исследования изменчивости ДНК проводились путем анализа с использованием большого количества рестриктаз в небольшой выборке особей (10 12). Результаты, полученные для хорошо изученных к настоящему времени областей генома (гемоглобина, альбумина и сегментов ДНК с неизвестной функцией из разных хромосом) [1143 1742 1959], свидетельствуют о том, что уровень нуклеотидной изменчивости приблизительно на порядок выше, чем наблюдаемый по структурным генам, кодирующим белки. Это означает, что разница между случайно выбранными хромосомами составляет в среднем 75оо" 7г5о нуклеотидов (гетерозиготность = = 0,001 — 0,004). Особенно подходят для выявления вариантов ДНК ферменты Мер и Тая1, узнающие метилированный динуклеотид СрО. Большинство вариантов по длине рестрикционных фрагментов диморфны, т. е. имеют только два аллеля -присутствие ( + ) или отсутствие ( —) сайта рестрикции. Частота полиморфного ва- [c.288]

Джеффризу с соавторами [14] удалось впервые показать, что зонды на основе кор-последовательности ГВР могут быть использованы для одновременного выявления большого количества соответствующих генетических локусов. С помощью зонда, синтезированного путем тандемного лигирования 33 повторяющихся элементов ГВР из гена человеческого миоглобина, они обнаружили на Саузерн- блотах, несущих гидролизат геномной ДНК человека, картину из большого числа полос. Некоторые из них оказались полиморфными шоследовательностями. Для выделения этих родственных участков исследователи отобрали из геномной библиотеки соответствующие клоны, используя в качестве зонда при гибридизации в мягких условиях конкатенированные повторы из гена миоглобина. Когда же эти выделенные клоны, в свою очередь, выступили в роли зондов, с помощью некоторых из них в геномной ДНК удалось выявить сложную картину гипервариабельных полос. Клоны содержали последовательности, имеющие области гомологии с тандемными повторами миоглобиновых ГВР, которые и представляли собой общие для этой группы кор-последовательности. Последовательности этого семейства были названы минисателлитами. Для изучения доступны два из них, являющиеся вариантами основной кор-последовательности. Соответствующие зонды, названные 33.6 и 33.15, существуют в виде рекомбинантных форм векторов, полученных на основе бактериофага М13 [17] (рис. 1). Каждая из них выявляет около 15 высокополиморфных полос в диапазоне 4—20 т.п.н. Среднее значение гетерозиготности по [c.192]

Выделенные фрагменты ДНК проверяют с помощью гибридизации с геномным саузерн-блотом. Гибридизацию проводят в присутствии немеченой эукариотической ДНК (50 мкг/мл), которая является конкурентом по отнощению к примесным повторяющимся последовательностям ДНК, присутствующим в зонде (разд. IV, Б). Далее, для того чтобы оценить чистоту зонда и подтвердить его локализацию на карте, проводят гибридизацию с блотом, содержащим рестрикционные фрагменты космидного клона. Фильтр, на котором идентифицировали малокопий-ные последовательности, может быть использован повторно, после того как меченую ДНК мыши отмыли в процессе двух 15-минутных инкубаций в растворе 0,lXSS , 0,1%-ноге ДСН при 90 °С. Выделенный фрагмент можно использовать для скрининга космидной библиотеки лишь в том случае, если оба эксперимента, включающие блот-гибридизацию по Саузерну, дают удовлетворительные результаты (нуклеотидная последовательность должна быть однокопийная и достаточно свободная от примесных рестрикционных фрагментов). [c.35]

Для получения полной или частичной геномной библиотеки проводят тотальное (валовое) клонирование всех выделенньгх фрагментов ДНК. Такой способ клонирования называют также щот-ган (shot-gun)-экспериментом. В случае же конструирования рекДНК, содержащей определенный ген с некоторыми известными характеристиками, фрагменты ДНК, получаемые под действием рестриктаз, разделяют с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях. Если размер фрагмента, несущего нужный ген, неизвестен, его находят методом гибридизации по Саузерну (см. приложение). Для этого разделенные фрагменты ДНК переносят из геля на нитроцеллюлозный фильтр, гибридизуют с радиоактивным РНК- или ДНК-зондом к нужному гену и подвергают авторадиографии. След на рентгеновской пленке указывает на положение искомого фрагмета ДНК в геле. Этот фрагмент [c.241]

Минисателлиты существуют в виде разбросанных по всему геному семейств, родство членов которых определяется гомологией с некоторой базовой последовательностью. Клонированный участки минисателлитов используют для приготовления зондов, с помощью которых при гибридизации в мягких условиях выявляют в геномной ДНК их множественные аллели. Один зонд с помощью блотинга по Саузерну позволяет наблюдать одновременно за наследованием нескольких десятков минисателлитов, расположенных в разных локусах, но относящихся к одному семейству. Ми-нисателлиты достаточно коротки, вследствие чего их длина в данном локусе относительно стабильна в ряду нескольких поколений. Поэтому они могут служить маркерами и позволяют проводить сегрегационный анализ и, кроме того, облегчают картирование сцепленных с ними генов. [c.296]

Гибридизация но Саузерну - метод обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей ДНК путем переноса электрофоретически разделенных фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизации последнего с мечеными ДНК-зондами. Образование гибридов обнаруживают методом авторадиографии. [c.124]

Возникновение и выявление тандемных повторов в ДНК на примере амплификации гена AD. А. Схема амплификации и образования нового рестрикционного фрагмента на месте соединения генов (Е1 ЕЗ- соР1-сайты). Б. Блот-гибридизация по Саузерну соР1-фрагментов ДНК из нормальных и С-клеток (табл. 10.6). В качестве зонда использовали фрагмент гена AD левее сайта Е2. В ДНК из нормальных клеток с зондом гибридизуется один сегмент (его длина 8.5 т. п. н.), присутствующий [c.313]

Прямое определение. Если генетическая болезнь является результатом делении ДНК, то для прямого выявления болезни можно использовать геномные ДНК-зонды или кДНК-зонды. При утрате значительного участка хромосомы, комплементарного соответствующему ДНК-зонду, последний не способен гибридизоваться на блотинговой пленке с ДНК, взятой у больного человека. Например, а-талассемия является результатом отсутствия в ДНК обоих а-глобиновых генов. В этом случае гомозиготность можно диагностировать по отсутствию любого фрагмента а-глобино-вого гена, гибридизующегося с а-генным зондом. Строго говоря, выявление гетерозигот с такими генными делециями не является прямым, поскольку зонд будет гибридизоваться с фрагментами ДНК нормальной хромосомы, дающими идентичное расположение полос на пленке Саузерна. Различие состоит в том, что интенсивность полос на авторадиограмме вдвое меньше, чем у нормальной ДНК (если, конечно, количество нормальной и гетерозиготной ДНК одинаковы), однако определить различия в дозах на блотинговых пленках Саузерна технически довольно сложно. При генетических нарушениях, локализованных в Х-хромосоме, по отсутствию гибридизации специфического зонда можно выявлять лица мужского пола с дефектным в результате делеции геном [20]. Но и в этом случае выявить носителей болезни женского пола можно лишь регистрируя обуславливаемый гибридизацией сигнал, составляющий по величине половину сигнала равного количества нормальной ДНК. [c.70]

Рис. 13-7. Результаты блот-гибри-дазации рестрикционных фрагментов гена ретинобластомы (задача 13-21). А. Картины гибридизации (Саузерн-блот) у здоровых людей и в случаях заболевания односторонней или двухсторонней ретинобластомой. Более светлая окраска полос указывает на вполовину меньшее, чем в норме, число юпий. Б. Расположение рестрикционных фрагментов. Фрагменты, содержащие экзоны (показанные в виде прямоугольников), гибридизуются с кДНК, использованной в качестве зонда в этих опытах.

Полимеразная цепная реакция Блот-гибридизация по Саузерну Прямая детекция мутаций (варианты) Олигонуклеотидные зонды Дагностика путём секвенирования гена [c.271]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология