Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Эндонуклеазы рестрикции рестриктазы

    В клетке межнуклеотидные связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами — обширным классом ферментов, представители которого различаются по механизму действия и специфичности (табл. 1), Среди нуклеаз, приведенных в таблице, нужно особо выделить эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). ферменты (их функции рассмотрены в гл. VI) узнают в молекулах ДНК не отдельные нуклеотидные остатки, а нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или шести остатков и поэтому расщепляют любую ДНК на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов. [c.13]


    Широкое распространение обмена ДНК между бактериями ставит перед ними задачу сохранения собственного генома. Далеко не всегда проникшая в клетку чужеродная ДНК.способна оказаться полезной. Более того, посторонний генетический материал может быть губительным для клетки, особенно если принадлежит бактериальному вирусу, бактериофагу. Для того чтобы бороться с чужеродной ДНК, нужно уметь отличать свою ДНК от чужой. Бактерии достигают этого те.м, что метят свою ДНК с помощью специального модифицирующего фермента. Практически все виды бактерий имеют метилазы, модифицирующие аденин или цитозин в определенной, характерной для данного вида последовательности ДНК- Другой специальный фермент, эндонуклеаза рестрикции (рестриктаза), узнает ту же последовательность и разрезает ее, если она не модифицирована, т. е. попала в клетку извне. Таким путем бактерии ограничивают возможности попадания в них постороннего генетического материала. [c.129]

    Один из подходов к решению проблемы деградации хозяйской ДНК гетерологичными эндонуклеазами рестрикции состоит в клонировании и экспрессии в реципиентном организме как гена фермента рестрикции, так и гена соответствующего модифицирующего фермента. Однако клонирование обоих этих генов в одном микроорганизме технически затруднено, если они расположены на хромосоме донорного организма далеко друг от друга. Кроме того, чтобы не допустить расщепления хозяйской ДНК эндонуклеазами рестрикции, метилирующий фермент после трансформации должен синтезироваться еще до начала синтеза рестриктазы. [c.248]

    Создают банк клонов ДНК организма-доно-ра, продуцирующего известную эндонуклеазу рестрикции. Используемый при этом плазмидный вектор должен содержать по крайней мере один сайт узнавания для этой рестриктазы. [c.248]

    Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов. [c.267]


    Главную роль на первом этапе выделения гена отводят эндонуклеазам рестрикции, или рестриктазам (см. гл. 9). Эти ферменты [c.268]

    Развитие технологии рекомбинантных ДНК было бы невозможно, если бы в распоряжении исследователей не было нужных эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). В настоящее время в продаже имеется более 300 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируются самыми разными микроорганизмами аэробными, анаэробными, фотосинтезирующими, диазотрофными. [c.247]

    Плазмиды как объекты генной инженерии позволяют in vitro сконструировать de novo геном клетки, используя эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), передать его в клетки реципиентов конъюгацией, трансформацией или трансдукцией и при включении в клетку большого числа плаз-мидных копий увеличить число необходимых генов. Конструирование и передача генома облегчаются спецификой генетической организации систем биодеградации. Во-первых, они локализуются в трансмиссивных плазмидах. [c.348]

Таблица 11.1. Некоторые эндонуклеазы рестрикции — рестриктазы, образующие фрагменты с липкими концами (из В. И. Таняшина, Таблица 11.1. Некоторые <a href="/info/33665">эндонуклеазы рестрикции</a> — рестриктазы, образующие фрагменты с липкими концами (из В. И. Таняшина,
    Бактерии, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, защищают собственную ДНК от расщепления с помощью ферментов, метилирующих те участки молекулы, с которыми связывается соответствующая эндонуклеаза рестрикции. Однако геном клетки-хозяина не защищен от рекомбинантной рестриктазы Fokl, и чтобы предотвратить гибель растущих клеток, синтез гибридного фермента подавляли, поместив ее ген под контроль системы экспрессии бактериофага Т7. [c.174]

    Микроорганизмы, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, выработали систему самозащиты они метилируют одно или несколько оснований рестриктазного сайта, и расщепление ДНК в этом сайте гомологичной эндонуклеазой рестрикции блокируется. Грамотрицательные микроорганизмы имеют еще один механизм защиты эндонуклеазы рестриьщии у них локализованы в периплазматическом пространстве. Благодаря такой компартментализации происходит физическое разделение рестриктаз и ДНК и при этом обеспечивается свободный доступ метилирующего (модифицирующего) фермента к хромосомной ДНК. Кроме того, это защищает клетку от проникновения в нее любой чужеродной ДНК, например вирусной. [c.248]

    Эти ферменты известны под общим названием эндонуклеазы рестрикции. Термин эндонуклеаза означает, что фермент катализирует расщепление нуклеиновой кислоты по внутренним фосфодиэфирным связям в отличие от зкзонуклеаз, катализирующих отщепление концевых звеньев нуклеиновой кислоты (к их числу относится упоминавшаяся в 7.3 фосфодиэстераза из змеиных ядов). Сокращенно эндонуклеазы рестрикции называют рестриктазами. В табл. 7.5 перечислены некоторые из наиболее широко используемых при изучении структуры ДНК и других биохимических исследованиях рестриктазы. [c.276]

    Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restri ting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, нуклеаза ) в строго определенных точках ( эндо означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отнощении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. [c.219]

    Из различных видов и щтаммов бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты рестрикции. Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых происходит разрез двойной спирали ДНК. В таблице 9.2 приведена их классификация. Функция некоторых из этих ферментов почти наверняка состоит в защите клетки от присутствия чужеродной немодифицированной ДНК. Однако, в клетках некоторых видов бактерий эндонуклеазы рестрикции хотя и присутствуют, тем не менее, они, по-видимому, не ограничивают проникновение чужеродной ДНК in vivo. Вероятно, эти ферменты осуществляют какие-то иные функции. Как бы то ни было, рестриктазы независимо от их функций in vivo служат мощным инструментом структурного анализа геномов. [c.270]


    Становление генной инженерии связано с открытием и использованием специального класса ферментов — специфических эндонуклеаз, или рестриктаз. Ферменты этого типа являются составной частью системы рестрикции — модификации прокариотических клеток. Разл.1чают три основных класса рестриктаз  [c.139]

    Системы рестрикции-модификации типа II устроены наиболее просто [74, 75]. В таких системах модифицирующая ДНК-ме-тилтрансфераза функционирует в виде свободного мономера, а эндонуклеаза рестрикции - в виде димера, причем эти два фермента не зависят друг от друга. Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, они активны в присутствии ионов Mg2+ без каких-либо дополнительных кофакторов и чаще всего используются при молекулярном клонировании, а также в ДНК-диагностике. [c.50]

    Эндонуклеазы рестрикции класса II, которые обладают уникальной способностью расщеплять ДНК по специфическим сайтам рестрикции, широко используются в генной инженерии (см. раздел 2.1 в первой части книги). Кроме того эти ферменты являются излюбленным объектом фундаментальных исследований, в ходе которых предпринимаются попытки объяснения их высокой специфичности. В настоящее время имеются данные рентгеноструктурного анализа, по крайней мере, для 12 рестриктаз, в том числе свободных ферментов, а также ферментов в комплексе с ДНК, содержащими соответствующие сайты рестрикции, и неправильными ДНК-субстратами. Среди этих ферментов эндонуклеаза ЕсоКЧ наиболее хорошо изучена и чаще всего используется в белковой инженерии [319]. [c.442]

    Представляемый читателям обзор А. Янулайтиса содержит исчерпывающую информацию относительно важного класса ферментов— специфических эндонуклеаз рестрикции II класса. Именно эти ферменты служат одним из главных орудий генных инженеров, лежат в основе методов физического картирования геномов, анализа последовательности нуклеотидов в ДНК. Обзор охватывает литературу до 1988 г. включительно и может служить полезным справочным материалом для широкого круга исследователей, применяющих рестриктазы II класса в своей работе. [c.3]

    Среди охарактеризованных специфических эндонуклеаз рестрикции также имеется группа ферментов, узнающих несимметричные последовательности нуклеотидов (табл. 8, типы 34—37). Эти участки по своей струк1уре напоминают последовательности, узнаваемые рестриктазами III типа (см. табл. 1). Всего идентифицировано 58 таких ферментов, узнающих 22 различных последовательностей. [c.40]

    Основным требованием при использовании рестриктаз в генно-инженерных и других молекулярно-генетических экспериментах является функциональная чистога, а именно, отсутствие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз. Поэтому, основные усилия при выделении и очистке рестрикционных эндонуклеаз направлены на получение функционально чистых их препаратов. Однако, для структурно-кинетических исследований эндонуклеаз рестрикции требуются относительно больщие количества гомогенных препаратов ферментов. Несмотря на то, что как уже отмечалось, в настоящее время охарактеризовано (и в большинстве случаев выделено) более 1000 рестриктаз, лишь небольшая их часть получена в го(могенном состоянии. [c.66]

    Как можно судить по немногочисленным данным относительно изоэлектрнческой точки эндонуклеаз рестрикции (см. табл. 19), рестриктазы являются слабокислыми белками (значения р1 находятся в области 4,6—6,3). Этот факт, на первый взгляд, вызывает некоторое изумление, так как наличие отрицательного заряда на белковой глобуле должно препятствовать образованию комплекса с отрицательно заряженной молекулой ДНК, однако, не следует забывать, что изоэлектрическая точка отражает электростатическое состояние всей белковой глобулы и поэтому не исключает существования положительно заряженных участков. [c.68]

    Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидрола-зами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фралментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, окрашенного бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II). [c.68]

    Следует отметить, что методы, предложенные для количественной регистрации активности рестриктаз являются методами с отбором проб в течение реакции и только в одной работе [159] был предложен непрерывный количественный метод регистрации скорости гидролиза ДНК, основанный на измерении флуоресценции при гидролизе кольцевой ДНК с интеркалированным бромистым этидием. В-третьих, для структурно-кинетических исследований рестриктаз требуются довольно большие количества, желательно, гомогенного белкового препарата фермента, что стало реальным лишь в последние годы в результате работ по клонированию генов целого ряда рестриктаз и созданию супер-продуцентных штаммов (см. разд. 5, часть II). В последние годы интерес к структурно-кинетическому изучению рестриктаз стал возрастать в связи с развитием исследований, направленных на установление механизма специфического узнавания ДНК белками, так как в этом ключе эндонуклеазы рестрикции являются исключительно интересными объектами. [c.69]

    Дальнейшее развитие исследования по изучению механизма гидролиза плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции получили в работах Халфорда с сотр. [159—162, 164, 245, 246]. В результате кинетических исследований процесса гидролиза плазмиды рМВ9, содержащей один участок узнавания рестриктазы E oR I, было установлено, что происходит накопление в растворе формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв. Таким образом механизм реакции является аналогичным таковому, предложенному для гидролиза ДНК вируса SV 40 рестриктазой E oR I [328]. [c.73]

    Как известно, эндонуклеазы рестрикции, при осуществлении процесса узнавания и расщепления, в большинстве случаев взаимодействуют с большим желобом двойной спирали ДНК [282, 338, 410]. Самым наглядным подтверждением этого является рентгеноструктурное изучение кокристалла рестриктазы E oR 1 и сайт-содержащего олигонуклеотида [45, 137]. Однако, в литературе также обсуждается и не менее важная роль малого желоба ДНК во взаимодействии с некоторыми рестриктазами [90, 127, 233, 265, 285]. [c.79]

    В этой работе использовался остроумный прием, позволяющий избежать образования побочных продуктов. Он заключался в синтезе симметричных димеров целевых блоков-д)ш-лексов. Центром симметрии в каждом сл)Д1ае выступали участки узнавания рестриктаз, имеющиеся в последовательности синтетического фрагмента. Это позволило устранить возможность образования неправильных комплексов благодаря запланированным самокомп-лементарным последовательностям половинных сайтов эндонуклеаз рестрикции. Целевые блоки-интермедиаты получали путем гидролиза соответствующими рестриктазами. [c.63]

    Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

    Эндонуклеаза (Endonu lease) Фермент, гидролизую-ший внутренние фосфодиэфирные связи и расщепляющий молекулы ДНК и РНК. Эндонуклеазы участвуют в рекомбинации, репарации и рестрикции в последнем случае называются рестриктазами (рестрицирующими эндонуклеазами). [c.565]

    В настоящее время рестриктазы подразделяют на три класса с )гчетом RMS-системы, в которой RMS — белки рестрикции, метилирования (модификации) и посадки соответственно К первому из них относят те рестриктазы, которые расщепляют ДНК в произвольных точках с образованием различных фрагментов ДНК (для обеих нитей ДНК известны системы R2M2S), ко второму классу (их известно около 500) относят ферменты, для которых сайты рестрикции и посадки совпадают — RS и MS Образующиеся при этом фрагменты (рестрикты) воспроизводятся по длине Рестриктазы этого класса, объединяющие рестриктазы вышеуказанных трех групп, преимущественно использзшэтся на практике Рестриктазы III класса (например из фага Р1, системы 2R MS) объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы Отдельные из них, например, не узнают сайтов посадки Их редко используют на практике [c.189]


Смотреть страницы где упоминается термин Эндонуклеазы рестрикции рестриктазы : [c.317]    [c.317]    [c.48]    [c.259]    [c.248]    [c.249]    [c.66]    [c.71]    [c.72]    [c.74]    [c.76]    [c.82]    [c.14]    [c.72]    [c.74]    [c.50]    [c.451]    [c.194]    [c.7]   
Генетика с основами селекции (1989) -- [ c.268 ]




ПОИСК





Смотрите так же термины и статьи:

Эндонуклеаза эндонуклеазы



© 2024 chem21.info Реклама на сайте