Клонирование, библиотеки к ДНК

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

Для скрининга библиотек на основе фага X можно использовать ДНК-зонды или иммунологические методы. Зоны лизиса (бляшки) переносят на фильтр и соответствующим образом тестируют. Если используется ДНК-гибридиза-ция, то вначале удаляют фаговые белки, затем ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. При тестировании иммунологическим методом белки, кодируемые клонированными генами. [c.74]

Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов X и Р1, а также плазмиды Р. [c.78]

Помимо описанного выще, для случайного мутагенеза используют и другие методы, например один из вариантов олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с применением ДНК фага М13. В этом случае затравкой для синтеза ДНК служит смесь олигонуклеотидов, содержащих случайные замены. В результате получают библиотеки клонов, несущих множество мутаций в различных сайтах. Недостаток подходов, при которых в клонированном гене образуется больщое число случайных мутаций, состоит в необходимости тестирования каждого клона для идентификации того, который детерминировал бы синтез нужного белка. Это весьма непростая [c.167]

Имеются два типа векторов обычные и специализированные. Обычные векторы клонирования дают возможность из огромного количества генов выбрать искомый и создать библиотеку генов, а специализированные связаны с экспрессией генов. Обычные векторы применяют в основном для вьщеления и изучения генов, входящих в состав генома различных клеток. Что касается специализированных векторов, то они представляют особый интерес для биотехнологии, так как экспрессия соответствующих генов дает основание для сверх синтеза целевых продуктов. Для этого ген, кодирующий необходимый белок, вводится в хромосому компетентных клеток и ассоциируется с промотором. [c.501]

ВАС-векторы получены на основе F-плазмид бактерий и содержат гены, ответственные за репликацию и копийность этих плазмид в бактериальных клетках, и ряд дополнительных последовательностей для облегчения клонирования. Емкость ВАС-векторов при собственном небольшом размере ( 7 т. н. п.) огромная — 100—300 т. н. п. Это позволяет во много раз уменьшить число клонов при получении геномных библиотек (см. ниже). [c.41]

Геномная библиотека (банк генов) представляет собой клонированный в составе векторов полный набор последовательностей ДНК данного организма. Фрагментация целого генома на отдельные участки значительно облегчает все генно-инженерные манипуляции и позволяет анализировать отдельные последовательности, проводить сравнительный анализ различных геномов по определенным участкам и, главное, выделять и работать с индивидуальными генами. [c.41]

Библиотека генома — набор клонированных фрагментов ДНК, содержащий весь геном. [c.458]

Поэтому для создания удобной библиотеки путем клонирования рестриктов пользуются приемом, так регулирующим частоту внесения разрывов, чтобы получились более длинные фрагменты. Для этого используют фермент с короткой (4 п. н.) последовательностью узнавания в условиях, обеспечивающих частичную рестрикцию [c.243]

Одна из основных целей клонирования различных фрагментов ДНК прокариотических и эукариотических организмов состоит в расчленении геномов на участки, достаточно малые для того, чтобы было возможно их детальное исследование. Интуитивно представляется очевидным, что, если накопить достаточно большое количество клонируемых фрагментов ДНК, эта коллекция будет включать по меньшей мере по одному экземпляру каждой последовательности генома. Такую коллекцию клонируемых фрагментов называют библиотекой генома или банком генов. [c.281]

Используемые при клонировании фаги X могут включать до 20 т. п. н. интегрированной чужеродной ДНК. С другой стороны, космиды (гибрид фага X с плазмидой) могут включать и переносить до 54 т. п. н. чужеродной ДНК. Что бы вы выбрали при создании библиотеки ДНК человека и почему Геном человека содержит около 3-10 нуклеотидных пар. [c.293]

Космидный вектор следует предпочесть вектору для клонирования на основе фага X, поскольку при использовании космид для полного перекрывания человеческого генома представительная библиотека должна включать меньшее количество клонов. Необходимое в каждом из случаев количество клонов можно рассчитать, как описано в приложении 9.2 [c.282]

Клонирование того или иного гена начинается с создания библиотеки ДНК в вирусном или плазмидном векторе. Принципы, лежащие в основе клонирования генов, для обоих этих типов векторов одинаковы, хотя в деталях методы могут и различаться. Ради простоты мы в этой главе пренебрежем различиями и проиллюстрируем методы, о которых идет речь, применительно к плазмидам [c.327]

Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в обработке донорной ДНК рестриктазой, уз-наюшей тетрануклеотиды. Такой рестриктазой является БаиЗМ, которая вносит один разрыв примерно на 256 пар оснований. Гидролиз проводят в таких условиях, чтобы происходило лишь частичное расщепление, так что образуются фрагменты всевозможных размеров (рис. 4.10). Частичный гидролиз позволяет клонировать целые гены, однако, поскольку сайты рестрикции расположены не случайным образом, некоторые фрагменты могут оказаться слишком крупными для клонирования. В результате в распоряжении исследователя оказьшается неполная библиотека, что может затруднить или даже сделать невозможным обнаружение искомой [c.63]

Иммунологический скрининг В отсутствие ДНК-зонда для скрининга геномной библиотеки можно использовать другие методы. Например, если клонированный ген экспрессируется, то его продукт - весь белок или его часть - можно обнаружить иммунологиче- [c.67]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т. п. н.), которые затем поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транскриптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. YA -вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы (рис. 7.3). При встраивании чужеродной ДНК в YA может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YA -векгоры несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. Несмотря на все преимущества, YA пока не использовались для промышленного синтеза гетерологичных белков. [c.137]

ELISA применяется для обнаружения различных белков, идентификации вирусов и бактерий, а также определения низкомолекулярных соединений в широком спектре биологических образцов. Чтобы повысить специфичность первых антител, для диагностики часто используют моноклональные антитела. При этом для уменьшения стоимости прибегают к технике клонирования их фрагментов в Е. соИ и получают комби-наторггую библиотеку, а на ее основе - широкий спектр комбинаций Fv-фрагментов. [c.201]

Рис. 10.13. Сконструированные участки ДНК из комбинаторной библиотеки кДНК Fv-фрагмента, клонированные в бактериофаг а. А и Б. Фрагменты ДНК L-( ) и Н-( ) цепей раздельно встроили в векторы на основе бактериофага а. В. Провели рестрикцию каждой iT oRI-библиотеки и лигировали фрагменты ДНК из библиотеки Н-цепи с фрагментами ДНК из библиотеки L-цепи, в результате чего получили комбинаторную библиотеку, содержащую все возможные сочетания фрагментов L- и Н-цепей с экспрессией соединенного фрагмента в одном векторе. pLa - /ас-промотор Е. соН, ССР - сайт связывания с рибосомой.

С помощью клонирования специфических генов и последующей их экспрессии в бактериях получен целый ряд белков, которые можно будет использовать в качестве лекарственных препаратов. Большинство этих белков имеют эукариотическое происхождение, так что для выделения нужного гена сначала получают препарат мРНК, обогащенный интересующими исследователя фракциями, затем создают кДНК-библиотеку и встраивают соответствующую ДНК в подходящий вектор для экспрессии. Произведя обмен участков родственных генов, кодирующих аналогичные белковые домены, или прямо заменяя сегменты клонированного гена, кодирующие функциональные части белка, можно создавать новые модификации таких белков. В качестве лекарственных средств можно использовать и некоторые ферменты. Например, для снижения вязкости слизи, которая накапливается в легких больных муковисцидозом, применяют в виде аэрозоля рекомбинантную ДНКазу I и альгинатлиазу. [c.224]

Чтобы проверить это предположение, пришлось сначала провести эксперименты по клонированию и экспрессии гена эстеразы ювенильного гормона. Фермент выделили из насекомого Heliothis vires ens (совки) и очистили. Определили его аминокислотную последовательность, синтезировали олигонуклеотид, соответствующий одному из сегментов белковой молекулы, и использовали его в качестве зонда для гибридизации. Из библиотеки кДНК [c.343]

Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олигонуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА),,-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны- [c.454]

Рис. 20.27. Прогулка по хромосоме . А. Зонд 1 гибридизуют с клонированным фрагментом ДНК длиной 40 т. п. н. После субклонирования и построения рестрикционной карты последовательность, дистальную по отношению к гибридизовавшейся, используют для создания зонда 2. Б. При помощи зонда 2 из библиотеки выбирают другой клон (отличный от клона 1) и используют последовательность, дистальную по отношению к гибридизовавшейся с ним, для создания зонда 3. Клоны 1 и 2 вместе составляют примерно 80 т. п. н. (за вычетом перекрывающегося участка - зонд

Геномная библиотека, банк (библиотека) генов (Genome lihrary) Набор клонированных фрагментов ДНК, в совокупности составляющих индивидуальный (групповой, видовой) геном. Если речь идет о крупном геноме (млекопитающие), то получают хромосомоспецифичные библиотеки. [c.546]

Методы быстрого определения последовательности РНК. Эти методы могут быть разбиты на две группы — прямые, когда анализу подвергается непосредственно РНК, и косвенные, когда анализируется, например, кДНК, полученная путем копирования РНК с помощью обратной транскриптазы и клонированная в составе какого-либо вектора, или соответствующий ген, кодирующий данную РНК после выделения его из библиотеки генов. Косвенные методы, естественно, являются методами анализа последовательности ДНК прямые же методы анализа РНК а>1алогичны используемым в случае дезоксирибонуклеотидов. Так же как и для ДНК, может быть применен метод копирования с терминирующими аналогами трифосфатов, но вместо ДНК-полимеразы используют обратную транскриптазу, а в качестве затравки — снитст ческие олигонуклеотиды или рестриктивные фрагменты, комплементарные дайной РНК. [c.328]

Если на первом этапе клонирования использовался метод дробовика , то бактерии, включившие донорную ДНК, совсем не обязательно будут нести фрагмент ДНК с нужным геном. Донорная ДНК представляет собой смесь очень большого числа рестрикционных фрагментов (в случае ДНК человека — до миллиона). Даже в том случае, когда все эти фрагменты клонируются, нужный ген или участок ДНК будет содержать только один из них или несколько. Смесь клонов, полученных таким путем, называется библиотекой. Библиотеку можно также получить, если на первом этапе использовать обратную транскриптазу и смесь мРНК. Иногда это приходится делать, если нужную мРНК нельзя выделить в чистом виде. Таким образом, в тех случаях, когда клонировался не одиночный ген (синтезированный или считанный с мРНК одного типа), после четвертого этапа получают бактериальные культуры в виде библиотек. [c.224]

Клонирование всей ДНК генома ( шотган ) с образованием библиотек генов [c.243]

Клонирование всего генома (в противоположность клонированию специфических фрагментов) часто называют шотган -экспериментами (shotgun experiment-метод дробовика). Для их осуществления весь геном разделяют на фрагменты удобного размера. Затем фрагменты встраивают в клонирующий вектор с образованием популяции химерных векторов. Набор таких клонированных фрагментов называют библиотекой генома. Библиотека, однажды полученная с помощью фагового или плазмидного вектора (чаще-фагового вектора, поскольку в таком виде легче хранить необходимые большие количества химерных ДНК), может храниться неограниченно долгое время и при появлении нового зонда быстро может быть использована для поиска специфического фрагмента. [c.243]

Как осуществляют селекцию определенного клона геномной ДНК из библиотеки Один из методов называется гибридизацией колоний. Последовательность операций этого метода приведена на рис. 19.8. Бактериальные колонии, несунще химерные векторы, лизируют на нитроцеллюлозных фильтрах. Затем их ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. Фильтр гибридизуют с радиоактивным зондом (обычно это клонированная кДНК), соответствующим интересующей исследователя последовательности. Все колонии, с которыми гибридизуется зонд, при авторадиографии выявляются в виде темных пятен. После этого соответствующие химерные векторы могут быть выделены из исходной библиотеки. [c.244]

Для гибридизации с зондом достаточно, чтобы клоны геномной ДНК содержали только часть комплементарной ему последовательности (обычно считают, что минимальный размер клонированной последовательности должен составлять около 50 п. н.). На практике, когда эукариотический ген имеет значительный размер, при создании библиотеки он может оказаться фрагментированным, так что разные участки гена окажутся в разных клонах, гибрвдизующихся с зондом. Полную нуклеотидную последовательность, соответствующую зонду, может не содержать ни один из клонов геномной ДНК. В этом случае необходимо реконструировать исходную геномную последовательность, используя наличие перекрываний индивидуальных фрагментов, которые, по всей видимости, имеют разные концы. [c.244]

Число случайно полученных фрагментов, которые должны быть клонированы для того, чтобы обеспечить высокую вероятность наличия каждой последовательности генома хотя бы в одной химерной плазмиде, уменьшается с ростом размеров фрагмента и увеличивается с ростом размеров генома и желаемой вероятности. Для 99%-ной вероятности необходимо 1500 клонов с фрагментами ДНК Е. соИ для дрожжей размер библиотеки возрастает до 4600 клонов, для D. melanogaster-до 48 ООО и до 800 ООО-для млекопитающих. Все эти библиотеки клонированных фрагментов, где достигается такая ве- [c.244]

Описанное выше в качестве одного из этапов клонирования разрезание генома на фрагменты с помощью рестрицирующей ххуклеазы называют иногда методом дробовика (шотган-клонирование). Фрагменты ДНК образуются при этом в огромном количестве - до миллиона, если речь идет о геноме млекопитающих, а это значит, что и число различных колоний трансфицированных клеток также должно достигать миллионов. Каждая такая колония представляет собой клон, т. е. совокупность потомков одной клетки-родоначальницы, и рекомбинантная плазмида в любой клетке клона несет одхху и ту же включенную в нее нуклеотидххую последовательность геномной ДНК. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а вся совокупность плазмид вмещает библиотеку геномной ДНК. Однако, поскольку разрезание геномной ДНК на фрагменты определяется случаем, лишь некоторые образовавшиеся фрагменты содержат полноценные гены во многие из них попадает только часть какого-нибудь гена, а в большинстве клонов геномной ДНК, полученных из ДНК высших эукариотических клеток. [c.328]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология