Фермент флуоресценцией

Если две различные молекулы расположены достаточно близко, они могут влиять на флуоресценцию друг друга. Одна из них, например, может поглощать излучение флуоресценции другой, свидетельствуя о довольно эффективной миграции энергии от одной молекулы к другой при облучении молекулярного комплекса. Такое взаимодействие может происходить между ароматическими аминокислотами, в ферментах и флуоресцирующих коферментах. Следовательно, можно определять и расстояние между этими молекулами. Кроме того, свет, излучаемый отдельными молекулами [c.84]

Интенсивность флуоресценции фермент-субстратного комплекса / пропорциональна его концентрации [c.86]

У флуоресцирующих групп, находящихся внутри белковой молекулы или соединенных с белком в виде комплексов фермент — кофермент или фермент — субстрат, также обнаруживается поляризация флуоресценции. Степень поляризации флуоресценции таких комплексов и влияние на нее различных факторов дают информацию о механизме действия фермента. Все это представляет ценность для анализа не только собственно ферментов, но и вообще всех белков. [c.85]

Если две различные молекулы расположены достаточно близко, они могут влиять на флуоресценцию друг друга. Одна из них, например, может поглощать излучение флуоресценции другой, свидетельствуя о довольно эффективной миграции энергии от одной молекулы к другой при облучении молекулярного комплекса. Такое взаимодействие может происходить между ароматическими аминокислотами, в ферментах и флуоресцирующих коферментах. Следовательно, можно определять и расстояние между этими молекулами. Кроме того, излучаемый отдельными молекулами данного вещества поток энергии определенным образом ориентирован по отношению к излучающей молекуле. Поэтому флуоресценция твердых тел сильно поляризована. В жидких невязких растворителях поляризация флуоресценции небольших молекул обычно мала, так как вследствие броуновского движения молекулы быстро меняют свое положение. Однако у больших молекул, таких, как белки, даже в жидких растворителях наблюдается менее интенсивное броуновское движение за время жизни возбужденного состояния они мало меняют свое положение, и поэтому их флуоресценция сильно поляризована. У флуоресцирующих групп, находящихся внутри белковой молекулы или соединенных с белком в виде комплексов фермент — кофермент или фермент — субстрат, также обнаруживается поляризация флуоресценции. Степень поляризации флуоресценции таких комплексов и влияние на нее различных факторов дают информацию о механизме действия фермента. Все это представляет ценность для анализа не только собственно ферментов, но и вообще всех белков. [c.178]

Если фермент-субстратный комплекс флуоресцирует в другой спектральной области, нежели исходные компоненты, можно, измеряя флуоресценцию этого комплекса, определить константу его диссоциации. В условиях избытка субстрата по сравнению с ферментом ([Eo]<[So]) система описывается следующими уравнениями [c.179]

Для количественного анализа взаимодействия проводят другой эксперимент, в котором определяют максимальный прирост интенсивности флуоресценции зонда при его полном связывании с белком. При этом постоянную низкую концентрацию аурамина О (которую выбирают таким образом, чтобы можно было зарегистрировать флуоресценцию зонда в буфере) титруют нарастающими количествами фермента. Строят график двойных обратных величин и проводят экстраполяцию к бесконечной концентрации белка. Таким образом устанавливают значение интенсивности флуоресценции данной концентрации зонда при его полном связывании с ЛДГ. Соотношение полученной величины с флуоресценцией данной концентрации зонда в буфере показывает, во сколько раз увеличивается флуоресценция аурамина О при связывании. Используют несколько концентраций аурамина О для титрования белком, что повышает точность определения величины прироста флуоресценции (Фтах). В этих экспериментах [c.342]

Наличие аномально большого сдвига спектра флуоресценции нашло весьма интересное применение в работе Джонсона и др. [70]. Поглощение пиридоксальфосфата в составе гликогенфосфорилазы при Я, = 330 нм (30 300 см ) может быть обусловлено либо образованием аддукта между одной из функциональных групп фермента и шиффовым основанием, образованным PLP и боковой цепью лизина (структура А), [c.34]

Фосфоресценция не наблюдается у соединений, обладающих сильной флуоресценцией. Фосфоресценцией обладают некоторые пестициды, анионные кислоты, ферменты, углеводороды нефти. Фосфоресценцию можно наблюдать при комнатной температуре для адсорбированных соединений благодаря стабилизации триплетного состояния. [c.161]

Например, пикосекундные сигналы, получаемые от работающего белка — фермента, трактуются как время релаксации светового возбуждения (снимаются спектры вынужденной флуоресценции), и из этого времени удается извлечь как период биохимического оборота в расчете на одну молекулу, так и положение и размеры непосредственно задействованного в каталитическую реакцию участка. При некоторых дополнительных опытах комбинированная информация становится и структурно-динамической в прямом значении этого понятия [227]. [c.316]

Рибофлавин, связанный с фосфорной кислотой, входит в состав ферментов, обычно называемых флавиновыми ферментами. Желтый рибофлавин сообщает желтую окраску флавиновым ферментам, входящим в группу аэробных дегидрогеназ. Таким образом, витамин Ва участвует в окислительно-восстановительных процессах. При восстановлении витамин Ва (желтый цвет) переходит в лейкоформу (бесцветный). Рибофлавин встречается в виде флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД), а также в связанном с белками состоянии, образуя качественно новые системы — желтые дыхательные ферменты. Нейтральный водный раствор рибофлавина обладает желто-зеленой флуоресценцией. При подкислении или при подщелачивании флуоресценция рибофлавина уменьшается и исчезает. В щелочной среде витамин Ва разрушается, в кислой среде он устойчив. [c.141]

Значительная чувствительность флуоресценции к внутримолекулярным и межмолекулярным изменениям позволяет выявить взаимодействия молекул, не обнаруживаемые другими методами. Так, ионизация и взаимодействие между мо.пекулами, которые трудно обнаружить спектрофотометрическими методами, могут изменять квантовый выход флуоресценции. Флуорофоры, взаимодействуя со специфическим ферментом, могут увеличить или уменьшить интенсивность его флуоресценции, и по степени изменения интенсивности можно судить о типе связи. Межмолекулярные и внутримолекулярные взаимодействия могут вызвать также изменения в спектрах возбуждения и флуоресценции. А по изменению спектров можно также судить об изменениях в структуре флуорофора, сопровождающих молекулярное взаимодействие. [c.84]

Для проведения измерения готовят раствор субстрата и фермента (в качестве субстрата используют 1-диметиламиноиафта-линсульфонил-пептид в качестве фермента — пепсин) в 0,1 М формиатном буферном растворе (pH 3,1). Концентрации субстрата (моль/л) 0,02-10-3 0,06-10- 0,Ы0- 0,15-10- 0 2-10-з. Концентрация фермента постоянна 7,14-10 моль/л. Измеряют флуоресценцию образовавшегося фермент-субстратного комплекса (А-воаб = 285 нм, >ифл = 500 нм) в каждом из растворов и строят график зависимости aji от l/[So]. По тангенсу угла наклона определяют константу диссоциации комплекса /(,. [c.86]

При введении тербия(П1) в каль-цийсвязывающий центр термолизина (гл. 7, разд. Г, 4) наблюдалась флуоресценция, обусловленная переносом энергии от иона кобальта(II), находящегося в центре связывания цинка. С помощью уравнения Фёрстера было получено расстояние между Са + и 2п2+, равное 1,37 нм, что согласуется с результатами рентгеноструктурного исследования этого фермента [66] [c.32]

Спектр люминесценции бактерий совпадает со спектром флуоресценции окисленного флавинового кольца. Были получены данные, указывающие на образование бактериями связанной с ферментом гидроперекиси восстановленного флавина [как в уравнении (10-50)]. Эта гидроперекись распадается на флавин и Н2О2, а кроме того, она может [c.74]

Свойственная полипептидам и белкам, содержащим остатки тирозина и триптофана, естественная флуоресценция чувствительна к окружению этих остатков. Это обстоятельство можно в ряде случаев использовать, чтобы получить информацию о конформационной подвижности боковых радикалов остатков тирозина п триптофана в отношении близлежащих группировок в полипептидной цепи. Один пример — это истолкование изменений флуоресценции а-химотрипсина, возникающих при изменении состава растворителя, откуда следует достаточно близкое для протекания взаимодействия с переносом заряда расположение группировки — ONH— к остаткам тирозина и триптофана [59]. Доступность такого рода остатков тирозина в рибонуклеазе установлена в результате в основном качественного изучения флуоресценции [60] три обращенных наружу остатка тирозина в ферменте теряют флуоресценцию после 0-ацетилирования, в то время как боковые группировки трех других остатков тирозина скрыты . Этот вывод подкрепляется увеличением флуоресценции после денатурации трис (0-ацетил) фермента [60]. [c.441]

Другой пример сильного взаимодействия белка с ДНК—регуляция оперона белком-репрессором. Наиболее изученным примером является 1ас-оперон Е. соИ [25]. Ген-регулятор кодирует синтез белка 1ас-репрессора, который затем связывается с соседним оператором. Связывание с белком-репрессором малой молекулы— индуктора, например изопропилтио-р- )-галактопиранозида, вызывает диссоциацию репрессора с операторного участка. Последующая транскрипция трех соседних генов оперона приводит к биосинтезу трех ферментов — Р-галактозидазы, галактозопермеазы и тиогалактозидтрансацетилазы. 1ас-Репрессор представляет собой тетрамерный белок, состоящий из идентичных субъединиц по 347 аминокислот каждая. Сродство репрессора к последовательности ДНК оператора зависит от ионной силы константа диссоциации в клетке, вероятно, менее 10 " моль/л . Структура участка связывания ДНК в 1ас-репрессоре до сих пор не выяснена, однако удаление трипсином 59 остатков с Л -конца и 20 остатков с С-конца предотвращает связывание. Несколько больше известно об участке связывания индуктора. Измерения флуоресценции показывают, что находящийся в участке связывания индуктора остаток триптофана при связывании перемещается в менее полярное окружение. Изучение изменения флуоресценции методом остановленного потока показывает, что процесс связывания проходит в две стадии. Быстрая начальная стадия подчиняется, как и ожидалось, кинетике второго порядка. Более медленная стадия мономолекулярна и, по- [c.569]

Связь флавина с протеином не во всех ферментах осуществляется по иминогруппе положения 3. В связывании флавина с белком в оксидазе В-аминокислот и в липоамиддегидрогеназе [4491 участвует рибитильная и адениловая части ФАД иминогруппа, по-видимому, остается свободной, так как эти ферменты обладают способностью к флуоресценции. [c.567]

Для непрерывного испускания света бактериям необходим фермент (названный бактериальной люциферазой), длинноцепочечный алифатический альдегид или родственное ему соединение в качестве субстрата (так называемого люциферина), молекулярный кислород и восстановленный флавинмононуклео-тид (РМКгНг). Полагают, что свет испускается в виде флуоресценции возбужденным окисленным флавиннуклеотидом, образующимся в ходе реакции. [c.389]

Соединения акридина вызвали значительный технический и научный интерес уже в 1871 г., когда Гребе [2] открыл акридин в высококипящей фракции каменноугольной смолы. Соединения акридина послужили исходным материалом для получения обширного ряда оранжевых и желтых основных красителей, а также красных и пурпурных кубовых красителей. Некоторые из них широко применяются и до настояш,его времени. Кроме того, из соединений акридина получают многие важные химиотерапевтические препараты, которые различаются по своей сложности к числу, их относятся как простые моно- и диами-ноакридины (применяются для профилактики и лечения хронического сепсиса ран), так и более сложные производные, которые оказались эффективными при малярии и лямблиозе (хинакрин и акранил). Интерес к соединениям акридина вызывается еш,е и тем, что многие из них обладают сильной флуоресценцией, а некоторые, например диакридилы,—довольно редким свойством хеми-люминесценции ( холодное свечение ). Наконец, акридины применяют и в других разнообразных областях их используют в качестве ингибиторов коррозии, в качестве реагентов для получения некоторых ферментов и для аналитических определений. [c.373]

Иммобилизованные ферменты нашли применение в автомат ческом анализе биологических субстратов и лекарственнь средств. В этом случае иммобилизованные ферменты являют рабочей частью автоматических проточных анализаторов. Анал зируемый раствор протекает по специальным трубкам, с внутре ней поверхностью которых ковалентно связан фермент. Субстр количественно превращается ферментом, что регистрируется изменению оптической плотности или флуоресценции жидкое (в зависимости от физико-химических свойств образующегося щ дукта). [c.324]

Тиамин (витамин В1) обычно определяют по синей флуоресценции его продукта окисления — тиохрома [4]. Образец для анализа (мясо, хлебные злаки, витаминные концентраты) после экстрагирования кислотой обрабатывают фосфатазой — ферментом, вызывающим гидролиз сложных эфиров тиаминфосфатов, которые часто присутствуют в продуктах питания. ФО Сфатазу и другие нерастворимые вещества отфильтровывают и фильтрат разбавляют до определенного объема. Берут две равные аликвотные части — одну для анализа, другую для холостого опыта. К первой прибавляют окислитель (ферри-цпанид калия) и к обеим частям — одинаковые количества едкого натра и изобутилового спирта. После встряхивания и последующего уда.ленля водного слоя спиртовой раствор исследуют в флуорометре. Всю операцию, включая и холостой опыт, повторяют с эталонным раствором тиамина. [c.63]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология