Степень поляризации флуоресценци

Степень поляризации флуоресценции (Р ) равняется [c.275]

Поляризация флуоресценции. Важной характеристикой фотолюминесценции является поляризация флуоресценции. Каждую молекулу можно рассматривать как колебательный контур — элементарный осциллятор, который способен поглощать и испускать излучение не только вполне определенной частоты, но и с определенной плоскостью колебания. Если на вещество падает поляризованный свет, то он преимущественно возбуждает те молекулы, в которых направление колебания осциллирующих диполей совпадает с направлением электрического вектора возбуждающего светового пучка. Поэтому несмотря на то что молекулы в растворе ориентированы хаотично, возбуждению подвергаются лишь те из них, которые обладают соответствующей ориентацией. Если.время жизни возбужденного состояния велико по сравнению со временем, необходимым для дезориентации молекул вследствие вращения, этот процесс дезориентации происходит еще до того, как появится заметная флуоресценция. Если же скорость вращательного движения мала по сравнению со временем жизни возбужденного состояния, то свет флуоресценции испускается до завершения дезориентации. При этом осцилляторы, ответственные за флуоресцентное излучение, ориентированы в той же плоскости, в которой они были ориентированы в момент поглощения, так что флуоресцентное излучение оказывается частично поляризованным. В очень вязких растворителях даже малые молекулы могут сохранять ориентацию за время испускания флуоресценции. Крупные молекулы, такие, как белки, сохраняют свою ориентацию в течение периода времени, который достаточно велик по сравнению со временем испускания флуоресценции, поэтому их флуоресценция частично поляризована. Степень поляризации флуоресценции определяется по формуле [c.56]

Если две различные молекулы расположены достаточно близко, они могут влиять на флуоресценцию друг друга. Одна из них, например, может поглощать излучение флуоресценции другой, свидетельствуя о довольно эффективной миграции энергии от одной молекулы к другой при облучении молекулярного комплекса. Такое взаимодействие может происходить между ароматическими аминокислотами, в ферментах и флуоресцирующих коферментах. Следовательно, можно определять и расстояние между этими молекулами. Кроме того, излучаемый отдельными молекулами данного вещества поток энергии определенным образом ориентирован по отношению к излучающей молекуле. Поэтому флуоресценция твердых тел сильно поляризована. В жидких невязких растворителях поляризация флуоресценции небольших молекул обычно мала, так как вследствие броуновского движения молекулы быстро меняют свое положение. Однако у больших молекул, таких, как белки, даже в жидких растворителях наблюдается менее интенсивное броуновское движение за время жизни возбужденного состояния они мало меняют свое положение, и поэтому их флуоресценция сильно поляризована. У флуоресцирующих групп, находящихся внутри белковой молекулы или соединенных с белком в виде комплексов фермент — кофермент или фермент — субстрат, также обнаруживается поляризация флуоресценции. Степень поляризации флуоресценции таких комплексов и влияние на нее различных факторов дают информацию о механизме действия фермента. Все это представляет ценность для анализа не только собственно ферментов, но и вообще всех белков. [c.178]

Рис. 16.10. Оптическая система для измерения степени поляризации флуоресценции раствора или расплава полимера.

У флуоресцирующих групп, находящихся внутри белковой молекулы или соединенных с белком в виде комплексов фермент — кофермент или фермент — субстрат, также обнаруживается поляризация флуоресценции. Степень поляризации флуоресценции таких комплексов и влияние на нее различных факторов дают информацию о механизме действия фермента. Все это представляет ценность для анализа не только собственно ферментов, но и вообще всех белков. [c.85]

В общем случае исследуют люминесценцию таких растворов (жидких или твердых), в которых молекулы растворенного вещества распределены равномерно и ориентированы беспорядочно, случайно. Ниже мы рассмотрим влияние случайной ориентации на степень поляризации флуоресценции, наблюдаемой под прямыми углами к пучку возбуждающего света. Для простоты рассмотрим сначала такое вещество, у которого направления переходных моментов для поглощения и для испускания одинаковы. [В первом приближении это отвечает случаю возбуждения типа 51- -5о и испусканию типа 5]-)-5о (см., однако, раздел I, Г, 5) в условиях, когда отсутствует деполяризация (т. е. в разбавленных твердых растворах см. разделы I, Г, 5 и I, Г, 6).] Поляризацию в отсутствие деполяризации называют предельной поляриза- [c.60]

При этом степень поляризации флуоресценции всегда меньше, чем возбуждающего света ( =1). (Теоретически Яфл может достигать значения 0,5 ).) [c.16]

Уменьшение степени поляризации флуоресценции по мере зеленения этиолированных биологических объектов, свидетельствующее о миграции энергии между химически идентичными молекулами хлорофилла а. [c.59]

При добавлении флуоресцеина к казеину наблюдается 20-кратное изменение интенсивности его триптофановой флуоресценции вследствие миграции энергии с триптофана на краситель и сокращение времени жизни возбужденного состояния. Параллельно степень поляризации флуоресценции казеина возрастает с 10 до 15—16%. [c.255]

Молекулы люминесцирующих веществ оптически анизотропны, поэтому люминесцентное излучение каждой молекулы частично поляризовано. Если анизотропные молекулы ориентированы хаотично, то вещество в целом становится изотропным, а его люминесценция — неполяризованной. При возбуждении вещества линейно-поляризованным светом его поглощение осуществляется молекулами, у которых поглощающий осциллятор параллелен электрическому вектору падающего света. Поэтому поглощение полностью отсутствует у молекул, поглощающий осциллятор которых перпендикулярен электрическому вектору возбуждающего света. В этом случае измеряют поляризационные спектры флуоресценции — зависимость степени поляризации флуоресценции объекта от длины волны возбуждающего света (поляризационные спектры по поглощению) или длины волны регистрации при фиксированной длине волны возбуждения (поляризационные спектры по испусканию). [c.211]

При связывании данного красителя мембранами или белками в определенной мере изменяются все параметры поглощения и флуоресценции, так как зонд оказывается в среде менее полярной и менее текучей, чем водный раствор. При взаимодействии АНС с различными мембранами происходит изменение положения максимумов поглощения и флуоресценции, интенсивности и степени поляризации флуоресценции, анизотропии поляризованной флуоресценции. Эти изменения позволяют количественно оценить степень связывания зонда с мембранами. Вместе с тем следует учитывать и тот факт, что характеристики связавшегося зонда сильно зависят от состава исследуемых мембран (митохондриальных, фосфолипидных, плазматических). Еще более чувствительным параметром является интенсивность флуоресценции, так как она определяется еще и количеством связавшегося зонда. [c.249]

Вторая группа включает методы, базирующиеся на изменении физико-химических свойств антигенов (или меток, связанных с антигеном) при комплексообразовании с антителами тушении или усилении флуоресценции, изменении степени поляризации флуоресценции, ингибировании ферментативной активности. [c.42]

Деполяризация флуоресценции. Альтернативой методу переноса энергии является метод деполяризации флуоресценции, предложенный авторами [4]. В основе последнего лежит различие скоростей вращательной диффузии свободного и связанного с рецептором аналога определяемого вещества. Когда аналог связан с высокомолекулярным рецептором, скорость его вращения замедляется, что приводит к уменьшению деполяризации испускаемого света. Таким образом, увеличение степени поляризации флуоресценции непосредственно связано с количеством связанного аналога. В наборах для иммуноанализа, основанного на этом принципе, можно использовать низкомолекулярные аналоги определяемых веществ, поскольку сохранение реагентов не составляет проблемы. В случае биосенсоров желательно, чтобы молекулы аналога были достаточно велики и удерживались диализной трубкой, так что молекулярная масса аналога должна быть порядка нескольких тысяч. Это, однако, приведет к снижению чувствительности метода, так как для больших молекул аналога различие скоростей вращательной диффузии в свободном и связанном состоянии уменьшается. [c.512]

Интересный метод определения коэффициента вращательной диффузии в и размеров молекул по поляризации флуоресценции разработан Вебером. Он получал химические соединения белков с флуоресцирующими красителями (например, с /-диметиламинонафталин-5-сульфонил-хлоридом) и измерял интенсивность флуоресценции по различным направлениям. Было показано, что степень поляризации флуоресценции наибольшая при малых 0, тогда как при больших 0 флуоресценция полностью деполяризована. Промежуточные значения степени поляризации флуоресценции отвечают определенным значениям 0, откуда по формуле (HI. 9), или по (П. 5.) вычисляются размеры молекул. Вебер исследовал этим методом размеры ряда белковых молекул и процессы их денатурации Гейнц применил этот метод к растворам полистиролов Валь — к растворам поливиниламинов и др. [c.67]

Вебер [99] определил молекулярную агрегацию некоторых альбуминов в зависимости от температуры и pH путем исследования степени поляризации флуоресценции, испускаемой производными альбуминов и флуоресцирующих красителей. Для возбуждения флуоресценции был использован нлосконоляризованный ультрафиолетовый свет. Предполагалось, что одна молекула красителя присоединяется к одному агрегату и что подвижность молекул красителя при этом становится такой же, как и у агрегатов. Измеряя степень поляризации испускаемой флуоресценции, можно рассчитать подвижность молекул красителя, а следовательно, и агрегатов. Вычислив подвижность, можно определить размеры агрегатов. [c.302]

Несмотря на большое значение, которое представляет знание длительности возбужденного светом состояния молекулы хлорофилла для изучения первичных фотохимических процессов при фотосинтезе, до настояш его времени не было проведено измерений этого времени наиболее надежными прямыми методами [1]. Время жизни х возбужденных молекул хлорофилла было оценено Перреном [2] и Ступпом и Куном [3] с помоп1 ью измерений относительной степени поляризации флуоресценции в растворителях различной вязкости. Полученные значения (3-10 и 1.5 X Х10 сек.), деленные на известный квантовый выход (приблизительно 0.25) позволяют оценить верхний предел естественного времени жизни 0 хлорофилла в растворах. Это последнее может [c.414]

Явление поляризации флуоресценции молекул в жидких растворах в электрическом поле (электрическая поляризация флуоресценции) было обнаружено Чекалла [126], который дал феноменологическую классическую теорию явления, разработал методику определения степени поляризации флуоресценции растворов и предложил использовать его для определения дипольных моментов возбужденных состояний флуоресцирующих молекул, в растворах. Суть эффекта заключается в том, что под действием сильного электрического поля ( 150 кв1см) происходит ориентировка анизотропных молекул, которые при возбуждении ультрафиолетовым светом излучают частично поляризованный свет люминесценции с очень небольшой степенью поляризации, зависящей линейно от квадрата напряженности поля [c.236]

Существование переноса энергии второго типа было показано в экспериментах по измерению поляризации флуоресценции растворов красителей при этом оказалось, что энергия возбуждения может передаваться на расстоянии порядка 50 А, что значительно превышает диаметр соударения. Если разбавленный раствор флуоресцирующего красителя в сильно вязкой среде освещают поляризованным светом, то испускаемая флуоресценция сильно поляризована (см. раздел I, Г, 4). Однако при увеличении концентрации степень поляризации флуоресценции резко падает [93, 94] например, при концентрации флуоресцеина порядка Ю З М она составляет половину максимального значения [67]. Эту концентрационную деполяризацию можно объяснить только тем, что излучателями флуоресценции становятся молекулы, отличающиеся от первично возбужденных. Эффект не удалось объяснить тривиальным механизмом испускания и реабсорбции. Перрен [95, 96] предположил, что перенос энергии может происходить в результате прямого электродинамического взаимодействия между возбужденной и невозбужденной молекулами, которые рассматриваются как высокочастотные осцилляторы. Количественная теория переноса этого типа была развита Фёрстером [97, 98] . В общем виде процесс можно записать следующей формулой [c.85]

Вебер показал, что степень поляризации возбуждающего света изменяется с изменением длины волны, но отклонения не превышают 10%- Соответствующая ошибка при определении степени поляризации флуоресценции была того же порядка, что и точность измерений, и поэтому не вводилось никакой поправки. Вебер также обсудил проблему деполяризации при поглощении флуоресценции в концентрированных растворах и вторичном испускании. Для измерения концентрированных растворов он использовал тонкие плепки, зажатые между гипотенузными гранями двух трехгранных призм из синтетической двуокиси кремния. [c.282]

Полиэтиленимин представляет определенные удобства для исследования флуоресцентным методом, так как он легко связывает флуоресцирующие красители и растворим в воде (которая является наиболее подходящим растворителем для исследования флуоресценции). Исследование Терамото и др. [81] зависимости обратной величины степени поляризации флуоресценции от Т х для конъюгатов полиэтиленимина с ДНС (прямая 1 на рис. 27) показало, что в изученном температурном интервале (10— 40° С) применимо уравнение Перрена и среднее время вращательной релаксации может быть определено из соотношения [c.106]

В противоположность фотосинтезу фотофизическая стадия зрительной рецепции не включает процессов меж-пигментной миграции энергии, т. е. поглощенная ретиналем энергия не делокализуется в пределах палочки. Это следует из проявления дихроизма родопсина палочек в режиме интенсивного фотовыцветания при облучении поляризованным светом и высоких значений степени поляризации флуоресценции замороженных спиртовых растворов родственного ретиналю витамина Аь Однако в пределах одной макромолекулы липохромопротеида имеет место миграция энергии от опсина к ретиналю с изомеризацией последнего. Квантовый выход изомеризации для > = 280 нм составляет всего 0,26 (для видимой области спектра 0,66). Это указывает на низкую эффективность миграции энергии между ароматическими аминокислотами опсина и ретиналем, которая, по данным Эбрей, не превышает 12%- [c.129]

Если возбуждение флуоресценции происходит в диапазоне главной полосы поглощения и энергия не теряется в результате межмолекулярных взаимодействий, то степень поляризации флуоресценции зависит от броуновского движения. Маленькие молекулы в водной среде вращаются очень быстро и между поглощением и эмиссией равновероятно принимают любую ориентацию, что приводит к полной дешхпяризации сигнала эмиссии. Так, в водном растворе флуоресценция флуоресцеина практически неполяризова-на, однако при повышении вязкости раствора степень ее поляризации возрастает. , [c.141]

Большие молекулы и при эмиссии частично сохраняют ту же молекулярную о жентацию, которую они имели при поглощении света, поэтому их флуоресценция поляризована. Если такие молекулы ассоциированы в молекулярный комплекс, то степень поляризации флуоресценции возрастает. Так как в поляризации флуоресценции важную роль играют размер и форма молекул, то это явление особенно полезно при контроле реакций антиген-антитело. Как показано на рис. 10.1, когда маленькая молекула антигена, меченного флуоресцентной меткой, образует комплекс с большой молекулой антитела, то вращение флуоресцентной метки замедляется и поляризация флуоресценции возрастает. [c.141]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология