Отбор и экспрессия гена

Таким образом, с помощью данной конструкции можно проводить клонирование, секвенирование и экспрессию генов под контролем сильных промоторов, а также прямой отбор рекомбинантов и сайт-специфический мутагенез. [c.154]

Истинный энзимолог редко интересуется проблемой сырья единственное, что ему нужно, — это выделить как можно больше фермента из наиболее удобного источника. В этом случае необходимо изучить литературу и выбрать лучший объект, с которым можно работать. При сравнении результатов, полученных в разных лабораториях, порой стоит самому провести несколько экспериментальных измерений. Очень важно убедиться в том, что фермент, присутствующий в исходном материале, экстрагируется из него полностью, для того чтобы можно было достоверно определить его содержание в ткани. При неполном разрушении клеток можно недооценить данный объект как источник ферментов из-за того, что значительная часть ферментативной активности не выходит в раствор, а удаляется вместе с осадком во время получения экстракта. Если фермент выделяют из бактериального. материала, то экспериментатор должен учитывать возможность отбора штаммов с аномально высоким уровнем ферментативной активности. Это можно сделать либо путем обычного отбора мутантов, либо используя более сложную технику клонирования, посредством которой множественные копии гена фермента включаются в бактериальный геном с помощью плазмид [1]. Экспрессия гена. может быть еще более усилена за счет его слияния с сильным промотором [2]. Эта работа занимает много времени, и выполнить ее может только опытный специалист не стоит даже пытаться применять эти методы, если на выделение фермента отведено мало времени. [c.37]

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА В СВЯЗИ С ОТБОРОМ [c.101]

Технология генетической инженерии состоит из следующих основных этапов получения трансгенных растений 1) выбор гена и его клонирование 2) подбор генотипа растения-реципиента 3) введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента 4) регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных растений. [c.49]

Получение растений, устойчивых к гербицидам, методами генной инженерии прежде всего основывается на изучении молекулярных механизмов толерантности и включает следующие этапы выявление мишеней действия гербицидов в клетке растений, отбор растений/бактерий, устойчивых к данному гербициду (в качестве источника генов резистентности), идентификация и клонирование этих генов, изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях. [c.74]

Негативный контроль обеспечивает механизм спасения с потерей функции если регуляторный белок инактивирован, система генов функционирует, и клетка, таким образом, не лишается необходимых ферментов. Легко представить, как такая система могла эволюционировать. Исходно система функционировала конститутивно, но затем клетки, способные специфически подавлять ее экспрессию, приобрели преимущество при отборе благодаря их возросшей приспособляемости. [c.188]

Предполагается, что мозаичная экзон-интронная структура генов, свойственная эукариотам, вероятно, была более древней, чем безынтронная, прокариотическая. В таком случае традиционные филогенетические представления, согласно которым прокариот помещают в основание эволюционного древа, а эукариот — на вершины, должны быть пересмотрены. Геном прокариот, как правило, не содержащий генов с интронами, рассматривается как компактный (рационализированный), образовавшийся в результате потери интронов, например, в результате отбора на скорость репликации. Напротив, предполагается, что мозаичная структура генов определяет эволюционные возможности генома, тогда как прокариоты, утерявшие интроны, представляют собой эволюционный тупик. Заметим, однако, что интроны, удаляемые в результате сплайсинга, изредка обнаруживаются при экспрессии генов в клетках бактерий, например в гене тимидилатсинтетазы фага Т4. [c.194]

Для отбора мутантов с дефектами экспрессии генов и регуляции обмена веществ используют эффективные кетоды селекции. Один из них состоит в получении мутантов, устойчивых к структурным аналогам целевого продукта (см. с. 35). В основе другого метода лежит выделение ревертантов из ауксотрофных мутантов. У таких мутантов восстановлена способность к синтезу конечного продукта, однако механизм ретроингибирования у них не функционирует вследствие изменения пространственной структуры ключевого фермента. [c.39]

Для идентификации трансформированных клеток необходимо уметь обнаруживать чужеродную ДНК, интегрировавшую в геномную ДНК растения. Более того, при исследовании сигналов регуляции транскрипции и их функций в специфических растительных тканях (листьях, корнях или цветках) зачастую важно уметь количественно оценивать уровень экспрессии гена, кодирующего легко идентифицируемый продукт. Все это требует применения репортерных генов, которые позволяют либо проводить отбор трансформированных клеток, либо оценивать активность кодируемого ими фермента. Было протестировано несколько разных генов, которые можно использовать как доминантные селективные маркеры, и генов, чей белковый продукт можно обнаружить с помощью специфических методов (табл. 17.4). Поскольку многие из ренортерных генов имеют бактериальное происхождение, они были снабжены регуляторными последовательностями, обеспечивающими их экспрессию в растительных клетках. Проводя отбор по доминантному маркеру, можно получить культуру, содержащую только трансформированные клетки. Так, в присутствии канамицина выживают только клетки растений, синтезирующих активную неомицинфосфо-трансферазу. [c.381]

Чтобы создавать рекомбинантные ДНК, несущие желаемый ген, необходимо прежде всего располагать этим геном. Для этого используют три основных способа. Во-первых, если известна первичная структура белка, получение которого желательно осуществить методами генетической инженерии, можно, основываясь на генетическом коде, построить нуклеотидную последовательность, программирующую этот белок, и осуществить химико-ферментативный синтез гена. Так, например, были осуществлены синтезы нескольких генов, кодирующих различные интерфероны. Во-вторых, можно выделить из тканей, в которых происходит экспрессия гена, информационные РНК, среди которых должна присутствовать и мРНК, кодирующая необходимый белок, провести с помощью обратной транскриптазы синтез комплементарной ДНК (сокращенно кДНК) и перевести ее в двунитевую структуру с помощью Д П<-полимеразы. Можно, наконец, вырезать желаемый ген непосредственно из ДНК того объекта, бело которого собираются продуцировать. Два последних подхода не дают сразу же индивидуального гена и требуют предварительного отбора из сложной смеси кДИК или фрагментов хромосомной ДНК. Эта проблема решается уяЛ на уровне илстои микроорганизмов, в которые введены новые наследственные программы, и пути ее решения будут изложены несколько ниже. [c.301]

Проблема была решена, когда удалось найти промотор гена нопалин-син-тазы и ввести его в Т.-плазмиду. Регуляторные системы гена — нопалин синтазы — способствовали экспрессии генов устойчивости к антибиотикам, и отбор трансформированных клеток оказался возможным на селективных средах, содержащих антибиотики. [c.505]

Варианты системы Y2H. Разработан ряд вариантов основной дрожжевой дигибридной системы, использующихся для отбора мутантных белков, взаимодействие между которыми нарушается в результате мутаций. В системе, получившей название обратной Y2H, для отбора белков с нарушенным взаимодействием применяют GaI4 DBD и AD, а также ген-репортер URA3 в качестве контр-селектируемого маркера (рис. 50, а). В такой системе вначале подтверждают взаимодействие между исследуемыми белками, выращивая клетки в отсутствие урацила, а затем отбор веществ, нарушающих взаимодействие между белками, проводят в присутствии 5-F0A. Клетки выживают лишь в том случае, если исследуемые белки в результате внешнего воздействия перестают взаимодействовать друг с другом, и экспрессия гена URA3 прекращается. [c.362]

Все это показывает, что пептидные аптамеры могут быть эффективным инструментом контроля бактериальной и вирусной инфекций высших животных и растений, а наличие высокоэффективных систем отбора делает пептидные аптамеры весьма привлекательными объектами исследований по разработке белковых препаратов, влияющих на экспрессию генов. Кроме того эти рекомбинантные белки пригодны для эффективного изучения механизмов белок-белковых и белково-нуклеиновых взаимодействий. [c.435]

B. Регуляция экспрессии генов путем отбора в ядре тех зрелых мРНК, которые будут перенесены в цитоплазму, называется контролем на уровне [c.159]

В. Данные, приведенные на рис. 10-27, указывают на то, что почти во всех клетках, несущих плазмиду с Ту-элементом, при росте на среде, содержащей галактозу, произощел один или более переносов. При каждом переносе возможно изменение активности или экспрессии генов, вблизи которых встроился Ту-элемент. Если этот элемент встраивается в кодирующую часть гена, это может привести к исчезновению активности, кодируемой данным геном. Если же он встраивается в некодирующую область вблизи гена, то может измениться экспрессия гена. В таких организмах, как дрожжи, которые очень хорощо приспособлены к своей экологической нище благодаря давлению отбора, случайное включение Ту-элемента скорее всего не улучщит их характеристики. Следовательно, высокий уровень переноса приведет, вероятно, к тому, что клетки будут хуже расти. [c.432]

Та ким образом, для того чтобы понять деятельность естественного отбора, необходимо учитывать фенотипическое проявление генов. В этой главе будут рассмотрены разные аспекты экс-пре>аси,и генов. Один комплекс вопросов группируется вокруг типа фенотипичеокого проявления в зависимости от фона, создаваемого средой другой комплекс касается степени изменяемости фенотипа а третий — разнообразных способов действия и взаи-модейсгаия генов. Еще один аспект экспрессии генов—роль генов, регулирующих ск0(р0сть филетических изменений,— рассматривается в гл. 30. [c.101]

Высказывались и некоторые другие мнения относительно возможностей сокращения платы за отбор. Сам Холдейн (Haldane, 1957) указал, что генетическая гибель была бы менее опасной для популяции, если бы она затрагивала эмбриональные или ювенильные стадии, а не взрослых особей. Поэтому факторы, благоприятствующие экспрессии генов и их подверженности отбору на ранних стадиях развития, могли бы сделать плату за отбор более терпимой. [c.181]

Отбор клеток, трансформированных ретровирусными векторами. А. Рекомбинантный геном содержит ген gpt Е.соИ. После проникновения вириона в клетку происходит образование дуплексной ДНК, катализируемое обратной транскриптазой, присутствующей в рекомбинантном вирионе. Эта ДНК встраивается в клеточный геном, образуя провирус. Трансформированные клетки можно отобрать благодаря экспрессии гена gpt, снимающей ингибирующий эффект микофеноловой кислоты. Если в рекомбинантную молекулу включен какой-то неселективный ген, он тоже экспрессируется. Б. Ретровирусный геном содержит онкоген. Трансформированные клетки можно идентифицировать по их способности образовывать фокусы, тогда как нетрансформированные клетки образуют лищь монослой. В этом случае в трансформированных клетках также экспрессируется неселективный ген, включенный в трансформирующий геном. [c.271]

Аналогичный прием был использован для исследования экспрессии уникальных генов яйцевода [Mizuno, Сох, 1979]. Здесь вели отбор меркурированной ядерной РНК. Варьируя продолжительность инкубации с большим избытком меркурированной РНК, при помощи колонки тиол-сефарозы можно отделять фрагменты ДНК, кодирующие редко или обильно представленные мРНК [Bajwa et al., [c.439]

Рис. 7.15. Двухвекторная система экспрессии. Клонированные гены (а и Р) кодируют субъединицы димерного белка ( Р). После одновременной трансфекции клетки двумя плазмидами в ней синтезируются обе субъединицы и собирается функциональный димерный белок. Оба вектора несут сайты инициации репликации, функционирующие в Е. oli (ori ) и в клетках млекопитающих (о/-/= ) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, эукариотический промотор (р) и сигнал полиаденилирования (ра), которые регулируют экспрессию селективного маркерного гена (СМ) и каждого из клонированных генов.

Если ген нужен для производства программируемого им белка, то с помощью аналогичных приемов его встраивают в специальным образом сконструированные плазмиды, в которых ген примыкает к эффективно работающему промотору РНК-полимеразы. При введении таких плазмид в соответствующие клетки последние начнут интенсивно нарабатывать информационную РНК, соответствующую этому гену, а с ее помощью и конечный продукт гена — белок. Векторы, используемые для этой цели, называют экспрессирующилт. Отбор клеток, которые экспрессируют встроенный ген, лучше всего вести непосредственно по накоплению продукта экспрессии в клопах, например используя радиоимму1Юанализ или иммуноферментный анализ с мечеными антителами к продуцируемому геном белку. [c.304]

Природный процесс имитируют так. Нарезают стебли или листья молодых побегов и наносят на них суспензию агробактерий. Повреждение тканей растения в нарезаемых кусочках (эксплантатах) облегчает перенос Т-ДНК из бактерии — ее рецепторы воспринимают выделяемые в разрезах фенольные соединения как сигнал к атаке . Далее процесс полностью зависит от агробактерии с ее отработанными за тысячелетия навыками генного инженера . Исследователь априори не знает, какая клетка эксплантата трансформируется, сколько копий Т-ДНК встроится в геном и в какие хромосомы, и не в силах это контролировать, но, одновременно модифицируя множество эксплантатов, впоследствии отбирает те регенерировавшие растения, что представляют для него интерес. Собственно, эта работа сродни труду селекционера, который после скрещивания из множества вариантов отбирает нужный. Как в обычной селекции есть маркеры (признаки), по которым ведется отбор, так и в генной инженерии есть набор генов-маркеров, по экспрессии которых определяются факт трансформации, эффективность работы введенных генов в определенных клетках и тка- [c.100]

Это означает, что в ядрах клеток кишечника имеются РНК-предшественники, содержание которых ограничено пределами ядра и из которых не образуется мРНК. Но в бластуле из тех же самых последовательностей образуются мРНК. Таким образом, в этом случае многие гены транскрибируются в тканях независимо от того, будут ли они в конечном счете экспрессироваться. Отбор транскриптов, которые подвергнутся процессингу и транспорту из ядра в цитоплазму, осуществляется только в определенных тканях. По-видимому, на уровне транскрипции осуществляется регуляция экспрессии только небольшого числа генов. [c.337]

Первичный транскрипт во всех случаях должен быть модифицирован посредством кэпирования, а обычно также и полиаденилирования. Из транскриптов прерывистых генов должны быть удалены интроны. Зрелая РНК должна быть экспортирована из ядра в цитоплазму. Пока еще невозможно провести различие между этими этапами с точки зрения их роли в регуляции генной экспрессии. Следовательно, вполне возможно, что регуляция путем отбора последовательностей на уровне ядерной РНК может происходить на любом из этих этапов или же сразу на всех. Какие-либо предположения о молекулярных механизмах (как качественных, так и количественных) регуляции генной экспрессии на уровне ядерной мРНК отсутствуют. [c.338]

В предельном случае вместо повторяющихся генов в клетках каждого типа могла бы находиться одна копия гена, который должен экспрессироваться. Каждая копия при этом регулировалась бы своим способом, специфическим для данного типа клеток. Независимо от того, коди- руют ли гены идентичные или сходные белки, не возникает проблем с осуществлением естёственного отбора, если имеется потребность в каждом гене в определенный момент времени или в определенном месте. Конечно, некоторые гены (может быть, их и большинство) присутствуют в количестве большем, чем одна копия на, генр.м. Нам до сих пор не известно, регулируется ли обычно экспрессия этих копий по-разному или они, как правило, представляют собой повторяющиеся последовательности, экспрессирующиеся одновременно и (или) в одном и том же месте. Начинает казаться, что обычно копии генов, по крайней мере слегка, различаются. На основе имеющегося к настоящему времени ограниченного числа данных можно предположить, что разные копии гена, по-видимо-му, экспрессируются в клетке в разных ситуациях. [c.339]

Смотреть страницы где упоминается термин Отбор и экспрессия гена: [c.60] [c.256] [c.318] [c.465] [c.377] [c.116] [c.347] [c.358] [c.360] [c.362] [c.362] [c.465] [c.29] [c.96] [c.220] [c.331] [c.465] [c.384] [c.234] [c.234] [c.331] [c.331]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология