Полимеризация нижнего геля

Растворы мономеров и катализаторов готовят на буферном растворе (pH 8,9) и смешивают в стеклянных трубочках для полимеризации. Для разделения липопротеинов сыворотки крови применяют дифференциальный электрофорез, используя три слоя гелей с концентрацией акриламида, повышающейся от верхнего слоя к нижнему. [c.154]

Полимеризация нижнего геля [c.282]

В тех случаях, когда готовят двухслойный гель, по окончании полимеризации нижнего геля воду отсасывают, поверхности промывают буфером верхнего геля, заливают этот последний и уже [c.28]

Электрофорез проводят в стеклянных трубках длиной около 70 мм с внутренним диаметром около 5 мм. Перед употреблением трубки тщательно промывают смесью хромовой и серной кислот или горячей азотной кислотой, водой и в заключение ацетоном. Сухие трубки держат вертикально и дно их закрывают резиновым уплотнением так, чтобы резина не входила в трубку. В качестве уплотнения можно использовать резиновые крышки к флаконам для сыворотки, перевернув их наоборот. Исходные растворы для приготовления геля (см. табл. 12.6 и 12.7) хранятся при 4°С в темных бутылях, которые выдерживают при комнатной температуре и откачивают водоструйным насосом, чтобы уменьшить содержание кислорода, ингибирующего полимеризацию. Если нижняя часть столбика геля не достаточно ровная, то в каждую трубочку вводят 0,1 мл 40%-ного раствора сахарозы и осторожно покрывают смесью для полимеризации разделяющего геля (табл. 12.7) до заранее отмеченной высоты, например 50 мм, т. е. около 2 мл смеси для полимеризации. Далее этот слой сразу же очень осторожно из шприца с тонкой иглой (по стенке трубки) покрывают 0,1 мл воды. Во время полимеризации трогать трубки не рекомендуется. После завершения полимеризации разделяющего геля воду удаляют ватным тампоном. Сухую поверхность разделяющего геля сначала промывают примерно 0,1 мл раствора для приготовления промежуточного геля (табл. 12.8), затем вводят 5 мм слоя (0,2 мл) раствора для приготовления промежуточного геля и быстро и осторожно покрывают 0,1 мл воды. Трубку освещают сверху флуоресцентной лампой со спектром дневного света, удаленной максимум на 50 мм. После окончания фотополимеризации слой воды удаляют, а поверхность геля промывают либо буферным раствором из верхней электродной камеры (табл. 12.9), если образец наносят в растворе, либо вновь раствором для приготовления фокусирующего геля, в который вместо воды добавляют образец. Если анализируются химически лабильные соединения, например ферменты, образец лучше наносить в виде [c.302]

Закрывают нижний конец трубки и заполняют ее указанным выше раствором, не доходя 5 мм до края. Сверху тонко оттянутой пипеткой наносят слой воды толщиной 3 мм. При химической полимеризации гель застывает через 20—30 мин после приготовления рабочего раствора (20—25°С). Для фотополимеризации необходима экспозиция при сильном освещении в течение 30 мин. В том и в другом случае скорость полимеризации можно снизить, охлаждая рабочий раствор. Перед заполнением трубок рабочий раствор нужно дегазировать, для этого его выдерживают в вакууме при осторожном встряхивании. Эта мера позволяет избежать появления пузырьков в геле во время электрофокусирования. [c.325]

Далее готовят разделяющий гель. Поверхность концентрирующего геля дважды быстро промывают смесью для получения разделяющего геля, а затем с помощью шприца заполняют трубку этой смесью так, чтобы получился выпуклый мениск, стараясь избежать образования пузырьков воздуха. Затем конец трубки плотно заклеивают полимерной пленкой. Всю эту процедуру необходимо провести в течение 5 мин после образования концентрирующего геля. Как только полимеризация закончится (через 30—40 мин), осторожно снимают колпачок, переворачивают трубку и аккуратно вставляют ее в резиновый колпачок нижним концом. Из другого конца, ставшего теперь верхним, удаляют раствор сахарозы и промывают поверхность концентрирующего геля смесью такого же состава. Затем наносят образец, включенный в смесь для приготовления стартового геля, и осторожно наливают электродный буфер до верхнего края трубки, не допуская перемешивания двух слоев. [c.263]

Описано применение в качестве прокладки П-образной полоски силиконовой резины с разрезом, позволяющим отнимать ее нижнюю часть после полимеризации геля. Такая прокладка [c.26]

М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 8.8. Полимеризация инициируется удалением воздуха из раствора и добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,8%) и персульфата аммония (до 0,015%). Пока не произойдет полимеризация, разделяющий гель держат под слоем воды. Воду выливают и наслаивают концентрирующий гель, или гель для нанесения, содержащий 4,5% акриламида, 0,12% бисакриламида и 0,1% ДСН в 0,125 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 6,8. Этот гель по-лимеризуется добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,125%) и персульфата аммония (до 0,05%). Перед полимеризацией, чтобы сформировать лунки для проб, в концентрирующий гель вставляют тефлоновую (фторопластовую) гребенку. После полимеризации образовавшиеся лунки промывают несколько раз электродным буфером, содержащим небольшое количество бромфено-лового синего. При этом удаляется непрореагировавший персульфат, а границы лунок слегка окрашиваются, так что их можно видеть при нанесении проб. Верхний электродный буфер содержит 0,182 М глицин, 0,0255 М трис (конечное значение pH 8,3) и 0,1% ДСН. Нижний электродный буфер содержит те же компоненты, за исключением ДСН. [c.157]

Первоначальная процедура заполнения трубок ак-риламидом, описанная Орнстейном [67] и Дэвисом [64], начиналась с полимеризации разделяющего геля в нижней части трубки. Позже была предложена методика [66], по которой разделяющий гель полимеризуется в верхней части трубки, так как при этом образуется более однородная граница раздела между концентрирующим и разделяющим гелями. Заполнение трубки проводят следующим образом. В резиновый колпачок наливают 0,2 мл 40%-ного раствора сахарозы и плотно прижимают трубку к дну колпачка, для того чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Трубку устанавливают в вертикальное положение затем готовят около 0,15 мл смеси для получения концентрирую -щего геля (см. ниже) и с помощью небольшого шприца с иглой (длина 8 см, внутренний диаметр 0,6—0,8 мм) наслаивают эту смесь на раствор сахарозы. На поверхность концентрирующего геля осторожно наливают немного воды так, чтобы не произошло перемешивания этих двух слоев и между ними образовалась резкая граница. Высокое разрешение достигается в основном благодаря образованию четкой ровной границы между [c.262]

С приготовленного разделяющего (нижнего) геля отсасывают всю жидкость н на глубину 1,5 см вставляют гребешок , формирующий карманы для образцов (таким образом, между этими карманами и верхним краем разделяющего геля остается расстояние по крайней мере в 1,5 см). Смесь концентрирующего геля дегазируют и после добавления ТЕМЭД (0,001 объема) наносят пипеткой на дно выемкн в стеклянной пластинке, после чего заливают его сверху бутанолом, насыщенным водой, и оставляют иа 30—60 мнн для полимеризации прн комнатной температуре. Удаляют гребешок и промывают концентрирующий гель верхним буфером с ДСН. После этого камера готова для нанесения образца и электрофореза (см. разд. И1). [c.75]

Прежде чем налить раствор верхнего концентрирующего геля, сливают бутанол и слой незаполимеризовавшегося раствора и промывают край нижнего геля верхним буфером. Остатки буфера можно удалить полоской хроматографической бумаги, не касаясь поверхности геля. Затем вставляют шаблон в виде гребешка (рис. 3, ) так, чтобы до поверхности нижнего геля оставалось около 5 мм, и заливают раствор верхнего геля. Гель оставляют для полимеризации на 30 мин, а затем пластинку сразу же используют в диск-электрофорезе, так как со временем различие в pH между верхним и нижним гелями сглаживается и в результате концентрирующая способность верхнего геля падает. После полимеризации концентрирующего геля нижнюю плексигласовую прокладку удаляют и камеру помещают в аппарат для [c.102]

Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок заклеивают парафильмом или лейкопластырем и устанавливают их строго вертикально в штатив. Деаэрированный раствор мономеров сразу после добавления и надежного смешивания с ним раствора персульфата аммония заливают по стенке трубки из пипетки с полиэтиленовым наконечником так, чтобы верхний участок трубки, предназначенный для внесения препарата, оставался сухим. Затем осторожно по стенке наслаивают воду или изобутанол и ведут полимеризацию, как описано в предыдущем разделе. Если готовят гель для ступенчатого электрофореза (см. ниже), то после окончания полимеризации нижнего (рабочего) геля воду стряхивают, споласкивают поверхности буфером верхнего (формирующего) геля и точно так же заливают слой раствора мономеров верхнего геля, а затем наслаивают на него воду или изобутанол. Перед установкой готовой трубки с гелем в прибор парафильм снимают, а ее свободный конец промывают верхним электродным буфером. [c.23]

Смесь для полимеризации следует готовить в количестве, необходимом для опыта. Если используют, например, 12 трубочек, нужно приготовить 30 мл смеси. Осторожным вращением колбочки раствор перемешивают и вносят пипеткой в трубочки, укрепленные в подставке, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не попали внутрь полимеризуемого геля. Уровень вносимой жидкости должен находиться на расстоянии 1—1,5 см от верхнего края трубочки. Сверху осторожно наслаивают воду (0,2—0,3 мл) для образования ровной поверхности геля. Полимеризация обычно заканчивается через 20—40 мин, что определяют по образованию хорошо видимой границы между гелем и водой. По окончании полимеризации наслоенную воду удаляют фильтровальной бумагой. Трубочки снимают с подставки и ввинчивают в отверстия дна верхнего буферного резервуара (рис. 10, /). Верхний резервуар присоединяют к нижнему, предварительно заполненному электродным буферным раствором. Следят за тем, чтобы на концах трубочек не было пузырьков воздуха. На поверхность геля микропипеткой наносят растворы белков. Количество наносимого белка зависит от его гомогенности для индивидуального белка — 25—50 мкг, для гетерогенных смесей это количество может быть увеличено до 50—250 мкг. Плотность наносимых образцов белка повышают добавлением 40%-ного раствора сахарозы до конечной концентрации 0,5 М (20%,). Это необходимо для предотвращения смешивания белка с электродным буфером. Высокая ионная сила исследуемых образцов мешает четкому разделению белков, поэтому такие растворы следует предварительно обессолить. [c.96]

Сформулировать принципы выбора состава смесей для получения жестких насадок с различными степенями проницаемости можно после того, как будут рассмотрены взаимосвязанные влияния сшивающего агента и разбавителя на структуру геля. Достаточная жесткость может быть получена при наличии 8—12% сшивающего агента в смеси мономер — разбавитель. Различные степени проницаемости при малых количествах добавленного сшивающего агента получили в результате изменения количества разбавителя с хорошим сродством к гелю. Изменение структуры геля при варьировании количества разбавителя, например при замене стирола толуолом, должно быть аналогичным различным стадиям полимеризации в неразбавленном сополимере. Сначала образуется гель с низкой степенью сшивания и слабо развитой тонкой структурой. Так, диапазон размеров молекул, фракционируемых на геле, приготовленном в присутствии 80% толуола, был весьма близок к верхнему пределу. В присутствии 60% толуола верхний предел размеров пор значительно уменьшился. Набухший в толуоле гель, полученный при содержании в смеси 8% дивинилбензола и 92% стирола в отсутствие разбавителя, был весьма мелкопористым и его калибровочная кривая поднималась вверх в области нижнего предела. В этой связи следует упомянуть также работу Миллара с сотр. [203]. [c.139]

Сузуки и др. [1253] предложили использовать электрофорез для выделения белков из любого типа геля после любого способа их фракционирования. Вырезанный участок геля с белковой зоной помещают в стеклянную трубку поверх слоя предварительно заполимеризованного геля, который не доходит на несколько миллиметров до нижнего конца трубки. Этот гель можно приготовить следующим образом. Сначала, как обычно, закрывают дно трубки н в нее до желаемой высоты наливают концентрированный раствор сахарозы или глицерина, на который затем аккуратно наслаивают забуференную смесь компонентов полиакриламидного геля. После полимеризации сахарозу или глицерин удаляют, дно трубми затягивают диализной мембраной, а образовавшееся между ней и гелем пространство заполняют буферным раствором. Такую трубку с находящимися в ее верхней части кусочками геля, содержащего сфокусированную при ИЭФ белковую полосу, устанавливают в аппарат для диск-электрофореза и проводят электрофорез в соответствующем буфере. Под действием электрического поля [c.151]

Система 3 [280]. Применяется для препаративного изотахофореза. 100 мл раствора акриламида [3,67% Т, 5% С, 0,012 М. трис —0,01 ЗМ какодилат (pH 7), 0,25 мг% рибофлавина, Ю мкл ТЕМЭД на 100 мл смеси] полимеризуют в стеклянной колонке длиной 30 ом (составная часть прибора Унифор фирмы ЬКВ-Рго(1ис1ег АВ). Полимеризация заканчивается после 3 ч облучения. Нижний электродный сосущ, и резервуар для буфера заполняют ведущим электролитом (0,012 М трис —0,013> М какодилат, pH 7), а замыкающий буфер (0,032 М трис — 0,188 М р-аланин, pH 8,95) наливают поверх геля и в верхний резервуар для буфера. Затем через капилляр, расположенный в верхней части прибора, на поверхность геля наносят слой амфолина (40%, ИЭТ 5—7) объемом 2 мл. Устанавливают постоянный электрический ток (10 мА), причем катод должен быть в верх1Н ем электродном сосуде. Через 5 ч после того, как весь амфолин войдет в гель, ток отключают и на поверхность геля через капилляр наносят пробу, состоящую из 2 мл сыворотки, смешанной с 2 мл замыкающего буфера. Затем вновь включают ток (10 мА) и начинают элюцию ведущим буфером. [c.177]

Для приготовления щелочного разделяющего геля смешивают 16 мл раствора А, 9 мл Раствора Б и 30 мл 8 М мочевины полимеризацию проводят, добавляя холодный раствор, содержащий 22,5 мг персульфата аммония в 15 мл 8 М мочевииы. Концентрирующий гель готовят, смешивая 1,8 мл раствора А, 1,8 мл раствора Б и 7,8 мл 8М мочевины полимеризацию проводят, добавляя раствор, содержащий 4,5 мг персульфата аммония в 3 мл 8М мо-чивииы. Верхнюю и нижнюю электродные камеры заполняют трис-глициновым буфером (0,05 М трис, 0,4 М глицин). Собирающая ячейка омывается раствором, содержащим 52 г трис, 14 мл уксусной кнслоты и 800 мл ЮМ мочевииы. [c.115]

В одной из стеклянных пластинок формы для геля второго направления делали вырез, подобно тому как это предусмотре- но в приборе Стадиера для электрофореза в вертикальных пластинах [Остерман, 1981]. Верхний электродный резервуар иа плексигласа (который при ИЭФ не должен быть- объемистым) имел точно такой же вырез в передней стенке. Этот резервуар через резиновые прокладки зажимами крепили прямо на пластинки геля, совмещая вырезы. При полимеризации верхнего, формирующего геля на поверхность раствора в вырез пластинки укладывали стеклянную палочку диаметром 3 мм (при толщине геля 0,8 мм). Таким образом, на торце геля после полимеризации образовывался желобок. В него с листа парафильма скатывали длинный и тонкий цилиндрик геля, расправляли его. и заливали расплавленным 1%-ным раствором агарозы. Плас-тину геля до уровня верхнего резервуара погружали в 20-литровый аквариум, заполненный нижним электролитом. Электрофо-рез вели в течение 10 ч при силе тока 50 мА. После фракциони- рования 20 мкг белка из клеток тимуса крысы с исходной С-радиоактивностью 5 10 имп./мин авторадиография при двухнедельной экспозиции выявляла 1750 пятен. В том же объ- екте при использовании гелей обычного размера обнаруживаются только 500 пятен. [c.49]

По окончании полимеризации всю пачку трубок следует извлечь из стакана, разнять, с каждой удалить гель (снаружи) и обрезать его излишек у нижнего конца. Возможно, хотя технически и более сложно, создание линейного градиента ПААГ за счет перемешивания двух одинаковых по высоте слоев раствора мономеров разной концентрации в наклонном положении [Ьо-теп1г, 1976]. [c.25]

Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а затем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя пластинами зеркального стекла толщиной 5—6 мм. Расстояние между пластинами задается толщиной прокладок из тефлона или плексигласа ( спейсеров ) и определяет толщину геля. Прокладки шириной 10—15 мм устанавливают вдоль боковых краев стекол. Для аналитических целей, как правило, используют пластины геля (и соответственно про1мадки) толщиной от 0,4 до 1,5 мм. Эти же прокладки можно использовать и для уплотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердевшего геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно такой же толщины (фрезеровать совместно ) по нижнему краю стекол и плотно прижимают ее к фрезерованным торцам боковых прокладок. [c.26]

Возможно одновременное заполнение целой стопки открытых снизу форм для геля (без нижних прокладок), которое проводят в сосуде прямоугольной формы, как описано выше для пучка трубок. Фирма Pharma ia (Швеция) предлагает для этой цели специальный сосуд прямоугольного сечения, где два любых набора могут быть зажаты с помощью клиньев, скользящих по двум наклонным плоскостям. Градиент концентрации акриламида подают на дно каждого из двух отделений сосуда через отдельные штуцеры. На фотографии (рис. 8) в сосуд установлена только одна пачка пластин. Бесполезный расход акриламида и загрязнение им пластин снаружи при использовании такого сосуда сведены до минимума. Подобного рода устройство из плексигласа для пластин любого размера легко изготовить в лаборатории. Кстати, в нем удобно заливать и обычные, не градиентные гели. Еще проще стопку пластин с боковыми проклад-. ками безо всякой герметизации поместить в полиэтиленовый мешок, плотно обернуть его вокруг пластин, зажать всю стопку и залить обычный гель прямо в мешок. После полимеризации мешок снимают, а излишки геля с нижних концов пластин обрезают [Ker kaert, 1978]. [c.29]

Возможно построить препаративную систему электрофореза с последовательной элюцией белковых полос с нижнего края пластины ПААГ. Фирма Bio-Rad предлагает для этой цели специальные прокладки, используемые при полимеризации геля. Конструкция прокладок позволяет подвести к нижнему краю рабочего геля толщиной до 6-мм по обеим его сторонам две трубочки, через которые потом и осуществляют элюцию белков. Сначала между стеклянными пластинками формы полимеризуют пробку из плотного ПААГ, затем, как раз на уровне трубочекги на высоту их диаметра, заливают слой раствора сахарозы, а над этим слоем уже полимеризуют рабочий гель. Сахарозу потом замещает элюирующий буфер. [c.117]

Боде (Bode, 1977] проводил полимеризацию акриламида из его 7,5%-НОГО раствора в 0,1 М фосфатном буфере (без добавления метиленбисакриламида) с помощью обычных инициаторных добавок под вакуумом в течение ночи. Он получил очень вязкую жидкость, содержащую длинные и спутанные нити линейного полиакриламида. Эту жидкость он смешивал в различных пропорциях с расплавленным 1%-ным раствором агара. При охлаждении смесей получались достаточно прочные гели, в которых жесткая и крупнопористая пространственная сетка агара была заполнена полужидким линейным полиакриламидом. Эта система обеспечивала такое же хорошее электрофоретическое разделение белков, как и нормальный ПААГ с тем же содержанием акриламида. Правда, нижний конец трубки при этом приходилось закрывать диализной пленкой во избежание вытекания геля . [c.149]

Разделяющий гель содержит градиент концентрации от 4.5 до 20 % полиакриламида. Этот градиент создают с помощью трех каналов перистальтического насоса Р-3 (РЬаппас1а, Швеция). Для того чтобы полимеризация проходила равномерно, полимеризующиеся блоки охлаждают. Для создания ровной верхней границы разделяющего геля на него наслаивают изобутанол, насыщенный водой. Электрофорез проводят в охлаждаемой камере. Стеклянные блоки прижимают специальными зажимами к передней части катодного отсека так, чтобы меньшая пластина была на уровне выреза в передней стенке прибора, а большая пластина бьша выше этого выреза. Носле заливки сочленений 1,5%о агарозой в электродный резервуар наливают верхний электродный буфер. Пластины опускают в нижний электродный буфер. Для того чтобы между прокладками и пластинами не протекал электрический ток, эти стыки проливают расплавленным парафином. Охлаждение гелевых блоков осуществляют, пропуская холодную воду через трубчатый холодильник, встроенный в анодную часть. Этот холодильник охлаждает нижний электродный буфер, в который были опущены стеклянные блоки. [c.59]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология