Рестрикции точка

Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки Е. соИ НЕ 101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом X. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа X, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой. [c.248]

Первым этапом анализа ДНК является экстракция ДНК из любой ткани, содержащей ядерные клетки с последующей ее очисткой. Далее геномную ДНК анализируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или подвергают расщеплению ферментами рестрикции — рестриктаза-ми, распознающими специфические последовательности нуклеотидов и гидролизующими ДНК на ряд фрагментов рестрикции . Последние могут быть разделены методом электрофореза или подвергнуты денатурации нагреванием до однонитевых фрагментов, которые затем переносят на нейлоновый фильтр или нитроцеллюлозную мембрану. Таким образом сохраняется пространственное расположение фрагментов ДНК относительно друг друга. Полученный материал анализируется с помощью ДНК-зонда, представляющего собой фрагмент одноцепочечной ДНК, как правило, помеченный радиоактивным изотопом Р и содержащий специфическую последовательность оснований, комплементарную участку ДНК, который необходимо обнаружить. В качестве зонда можно использовать как нативную ДНК, специфичную гену (геномные зонды), так и синтетическую ДНК, полученную на основе РНК гена (комплементарная ДНК). Если анализируемая последовательность присутствует во фрагментах рестрикции, то зонд гибридизуется с ними, что можно обнаружить с помощью авторадиографии. [c.528]

Гораздо точнее можно измерять параметры клеточного цикла у клеток, растущих в культуре, где легко контролировать и изменять условия среды. Деление клеток в культуре можно замедлить или остановить, ограничивая поступление необходимых питательных веществ или белковых факторов роста, добавляя небольшие количества ингибиторов белкового синтеза или увеличивая плотность культуры. Во всех этих случаях клеточный цикл останавливается в фазе 01 по-видимому, если клетка прошла эту фазу, она уже не может не пройти также и фазы 8, Ог и М. Как показали эксперименты, в конце фазы 01 есть определенный момент, после которого возврат в 61 невозможен. Этот момент получил название точки рестрикции (точка Я). После того как клетки минуют ее, они неизбежно завершают цикл, проходя его с обычной скоростью, независимо от внешних условий (рис. 11-4). [c.142]

Сейчас известно, что рестрикция связана с расщеплением фаговой ДНК эндонуклеазой, специфически узнающей определенную последовательность нуклеотидов, а модификация состоит в метилировании той же последовательности. Различают системы рестрикции и модификации 1, 11 и III типа. [c.130]

Подобная сложность систем рестрикции I типа привела к предположению о том, что эти ферменты играют в клетках какую-то роль помимо рестрикции. Однако другие функции рестриктаз пока не обнаружены. [c.132]

Бактерии часто переваривают и разрушают ДНК вторгшихся в них вирусов или ДНК, попавшую в клетку при спаривании с бактерией несовместимого штамма. В результате исследований этого интересного явления, получившего название рестрикция, было обнаружено, что ДНК вирусов, способных к репликации лишь в определенных клетках-хозяевах, в специфических местах каким-то образом маркирована. Причем во многих случаях метками являются метильные группы. Оказалось, что соответствующим образом метилированная ДНК не расщепляется бактерией, тогда как неметилированная ДНК расщепляется высокоспецифичной эндонуклеазой именно в тех местах, в которых обычно происходит метилирование. У каждого вида бактерий (а часто даже и у отдельных штаммов в пределах данного вида) имеются свои собственные рестриктирующие ферменты. Рестриктирующие ферменты обладают очень высокой степенью специфичности и часто разрезают ДНК всего лишь в нескольких точках (или рядом с ними), для которых характерна уникальная последовательность оснований. В настоящее время удалось выделить около 45 таких ферментов с разной специфичностью. [c.279]

Механизм инактивации и избирательного разрушения хромосом остается неизвестным предполагается, что в своей химической основе он имеет сходство с процессами модификации и рестрикции, свойственными бактериям (гл. 15, разд. Е) [182]. С помощью системы метилирования одна хромосома может быть помечена и сохранена, тогда как другая — подвергнуться последовательным воздействиям отстригающей эндонуклеазы. С другой стороны, не исключено, что какой-то другой фермент инициирует переход хромосом в гетерохроматин. [c.363]

Ключевым моментом этого метода является то, что плазмидная ДНК клонов, несущих и экспрессирующих ген фермента модификации, оказывается устойчивой к расщеплению соответствующей эндонуклеазой рестрикции, поскольку сайты узнавания в ней метилированы. [c.248]

Рис. 20.11. Использование рестрикционных сайтов в качестве генетических маркеров. А. Замена одной пары нуклеотидов в рестрикционном сайте приводит к тому, что рестриктаза не распознает его и не расщепляет ДНК. Интактный и измененный сайты рестрикции отмечены знаками (+) и (—) соответственно. Б. Участок одной хромосомы, содержащий три сайта (А, 1 и В), узнаваемые одной и той же рестриктазой. X - расстояние между сайтами А и 1, У - расстояние между сайтами 1 и В, X + У -расстояние между сайтами А и В. Сайты А и В во всех случаях интактны (оба +), а сайт 1 может быть как интактным (+), так и измененным (-). Если сайт 1 интактен (+), то после обработки ДНК рестриктазой образуются фрагменты X и У. Если же он изменен (—), то образуется единственный фрагмент (X + V). Если провести блот-гибридизацию по Саузерну с зондом а, то мы обнаружим фрагмент X в том случае, если сайт 1 интактен (+), и фрагмент (X + V), если он изменен (-). В. Фрагменты, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации по Саузерну с зондом а, для каждого из генотипов (+/+, +/-, -/-). Г. Фрагменты одной хромосомы, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации с зондом Р или у.

Участки ДНК, по которым происходит расщепление той или иной рестрикта-зой, называют сайтами рестрикции. Поскольку эндонуклеазы рестрикции используются не только для подготовки ДНК к секвенированию, но и для других целей, в частности для генной инженерии (см. 7.11), распределение сайтов рестрикции вдоль молекулы ДНК является важной характеристикой ДНК. Установление взаимного расположения этих сайтов называют физическим картированием ДНК, а саму схему такого распределения — физической картой ДНК. [c.276]

Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул,— рестриктазы II типа. Основной характеристикой таких рестриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте на 180° последовательностями — палиндромами [c.26]

Технология выделения и экспрессии чужеродных генов в Е. соН и в некоторых других микроорганизмах достаточно хорошо отработана, однако не стоит забывать, что синтез гетерологичного белка в организме-хозяине может оказывать на него негативное влияние. Например, сверхпродукция такого белка может привести к истощению метаболических ресурсов хозяйского организма и отрицательно повлиять на его рост. Присутствие гетерологичного белка может оказаться даже губительным для клетки-хозяина. Так, сайты рестрикции имеются во всех молекулах ДНК, и если продуктом клонированного гена является эндонуклеаза рестрикции, то в отсутствие специальных защитных механизмов хозяйская ДНК будет расщепляться ею. [c.247]

Большинство рестриктаз класса II узнают на ДНК последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, обладающих осью симметрии второго порядка. В 1973 г. американские И1-следователи X. Смит и Д. Натане предложили номенклатуру для обозначения ферментов системы рестрикции — модификации. В соответствии с этой номенклатурой, которая сегодня является общепринятой, первая буква рода и две первые буквы вида образуют состоящие из трех букв сокращения источника выделения фермента. Эндонуклеазы обозначают символом R, метилазы — М. Если из одного типа клеток выделены два или больше ферментов рестрикции, то их нумеруют соответственно римскими цифрами. Исходя из этой номенклатуры рестриктазы Е. oli [c.139]

Системы рестрикции II типа обнаружены у очень многих бактерий. Эти системы состоят из двух отдельных ферментов, рестриктазы н метилазы, узнающих одну и ту же последовательность ДНК — сайт рестрикции. Если сайт рестрикции не метилирован, то рестриктаза вносит в него двуцепочечный разрыв. ДНК не подвергается рестрикции, если хотя бы одна цепь метилирована. Такие свойства предохраняют собственную ДНК бактерий от рестрикции собственная ДНК либо полностью метилирована по всем сайтам рестрикции, либо, после репликации, патуметилирована. На полуметилированные сайты рестрикции действует метилаза и метилирует их полностью. Как и прочие клеточные метилазы, метилазы системы рестрикции-модификации в качестве донора метильных групп нс-патьзуют 5-аденозилметионин. В табл. 7 для примера приведены данные о некоторых рестриктазах и метилазах II типа. [c.130]

Р. осуществляются только в отношении двухдепочечных молекул ДНК. Одноцепочечщ.1е ДНК нек-рых фагов модифицируются или подвергаются рестрикции только тогда, когда они находятся в фазе репликации. В то же время для обеспечения устойчивости к рестриктазам достаточно модификации только одной из цепей ДНК. По этой причине ДНК, образующаяся в ходе полуконсервативной репликации, защищена от действия собств. клеточных рестриктаз благодаря модификации матричной цехш. [c.259]

Синтетические декамерные дуплексы такого рода предназначены для присоединения встык к генам ДНК, полученным химически или ферментативно путем связывания лигазами. Когда они затем подвергаются зависимому от последовательности эидонук-леазному действию фермента рестрикции (см. разд. 22.4.3), они превращаются во фрагменты, имеющие липкие концы. Поскольку идентичные липкие концы могут быть получены в результате действия того же фермента рестрикции на бактериальную хромосому, то может быть создана возможность для введения искусственного гена в хромосому (см. разд. 22.5.4). [c.183]

Для осуществления молекулярного клонирования недостаточно одних только ферментов рестрикции. Во-первьгх, водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Необходим какой-то инструмент для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы, т. е. для восстановления связи между 3 -гидроксильной концевой группой одной цепи и 5 -фосфатной группой другой. Таким инструментом является ДНК-лигаза бактериофага Т4. Этот фермент катализирует образование фосфо-диэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов. Кроме того, ДНК-лигаза Т4 сшивает тупые концы, которые сближаются друг с другом после того, как объединяемые фрагменты связываются с ферментом (рис. 4.6). Во-вторых, объеди- [c.55]

Анализ реальных образцов ДНК несколько более сложен, поскольку хромосомы встречаются парами (рис. 20.11, В). Однако и в этом случае каждому генотипу (+/+, +/-, -/-) соответствует определенный набор фрагментов, образующийся в результате гибридизации с зондом. Кроме того, для выявления сайта рестрикции на участке 1 можно использовать зонды, гибриди-зующиеся с другими участками ДНК между сайтами А и В (рис. 20.11, Г). Феномен, состоящий в том, что наличие часто встречающегося в популяции измененного рестрикционного сайта приводит к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называют полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (НДРФ). Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют. [c.453]

Существование механизмов переноса генетической информации с помощью фагов и плазмид позволяет предполагать, что архебактерии должны каким-то образом защищать собственный генетический материал от чужеродного. У эубактерий эта проблема реще-на с помощью системы рестрикции-модификации. У эукариот такой системы нет, они выработали иные механизмы генетической изоляции. Найдено, что архебактерии обладают системой рестрикции-модификации, аналогичной эубактериальной. [c.412]

Сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции Ват Н1 имеет последовательность GGAT , которая кодирует дипептид Glj—Ser. Для того чтобы нарушить сайт узнавания, достаточно заменить один из нуклеотидов. Учитывая, что Gly кодируется четырьмя, кодонами GGN, а Ser — кодоном U N, где N - любой из четырех нуклеотидов, то достаточно [c.444]

Так как необходимо ввести липкие концы в фрагмент ДНК, который вставляется по сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции E oRl, то первым аминокислотным остатком должен быть Asn (кодон AAU). Кодон второго аминокислотного остатка должен начинаться на и, т.е. это могут бьггь Phe, Leu, Ser, Tyr, ys, Trp. И лишь третий аминокислотный остаток может быть любым. [c.445]

Получение генов. Их возможно получать методом химического синтеза, выделением из геномов живых организмов, а также при помоши обратной транскриптазы, которая на соответствующей мРНК кодирует комплементарную ДНК (кДНК). Первый и второй методы имеют ограниченное применение. Химический синтез — достаточно длительная и дорогостоящая процедура. Вьщеление однородных фрагментов ДНК осуществляется при помощи ферментов-рестриктаз, которые узнают и расщепляют ДНК в строго фиксированных точках. Эти ферменты функционально связаны с модифицирующими метилазами следующим образом метилазы осуществляют метилирование в сайтах ДНК, которые атакуются рестриктазами. Метилирование защищает собственную ДНК клетки от неспецифической фрагментации, в то время как чужеродная ДНК немедленно разрушается. В месте разрыва полинуклеотидных цепей образуются, в частности, липкие концы, способные образовывать между собой комплементарные пары оснований. Открытие В. Арбером рестрикции и использование ее для получения генов было отмечено Нобелевской премией. В настоящее время идентифицировано более 500 рестриктаз, причем их название складывается из первой буквы рода микроорганизма и двух пер- [c.499]

В настоящее время рестриктазы подразделяют на три класса с )гчетом RMS-системы, в которой RMS — белки рестрикции, метилирования (модификации) и посадки соответственно К первому из них относят те рестриктазы, которые расщепляют ДНК в произвольных точках с образованием различных фрагментов ДНК (для обеих нитей ДНК известны системы R2M2S), ко второму классу (их известно около 500) относят ферменты, для которых сайты рестрикции и посадки совпадают — RS и MS Образующиеся при этом фрагменты (рестрикты) воспроизводятся по длине Рестриктазы этого класса, объединяющие рестриктазы вышеуказанных трех групп, преимущественно использзшэтся на практике Рестриктазы III класса (например из фага Р1, системы 2R MS) объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы Отдельные из них, например, не узнают сайтов посадки Их редко используют на практике [c.189]

Уже давно было известно, что в бактериальной ДНК среди миллионов обычных оснований (А, Т, G и С) встречаются основания, несущие дополнительные метильные группы. Биологическое значение этих метилированных оснований стало понятным в результате ряда важных открытий, которые оказали большое влияние на развитие генетики и, в частности, биохимической генетики. Для каждого вида бактерий характерна своя особая картина распределения метилированных оснований по ДНК, отличающая ее от ДНК других видов. Если ДНК какого-либо другого вида каким-то образом проникнет в живую бактериальную клетку, то она будет признана там чужеродной именно по отсутствию в ней специфической для данного вида картины распределения метилированных оснований, присущей ДНК клеток этого вида. В такой ситуации чужеродная ДНК будет разрушена специфической нуклеазой, которая расщепляет обе цепи ДНК непосредственно в том месте, где отсутствуют характерные для ДНК клетки-хозяина метилированные основания, или вблизи этого места. Таким образом чужеродные ДНК подвергаются рестрикции они разрушаются с помощью специфических ну-клеаз, вырабатываемых каждым видом бактерий. [c.880]

Интересно, что этот короткий участок ДНК, метилированный или неметилиро-ванный, обладает внутренней симметрией относительно центральной точки, показанной красным цветом. Если повернуть этот участок на 180° в плоскости рисунка вокруг центральной точки, то он будет читаться точно так же, как до поворота. Такой тип симметрии характеризуется осью симметрии второго порядка. Больщинство проверенных последовательностей модификации-рестрикции обладают симметрией второго порядка. Рестриктирующая эндонуклеаза Hind II расщепляет обе цепи в середине этого участка в любой ДНК, в которой эта последовательность не метилирована. Будучи расщепленной таким образом, чужеродная ДНК не может быть исправлена и поэтому не может реплицироваться. [c.880]

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restri ting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, нуклеаза ) в строго определенных точках ( эндо означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отнощении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. [c.219]

Плазмиды несут ген, кодирующий фермент р-галактозидазу, причем этот ген дополнительно содержит несколько сайтов рестрикции, которые не влияют на функцию гена. р-Галактозидаза — это фермент, расщепляющий лактозу на галактозу и глюкозу. При действии данного фермента на бесцветное вещество Х- а1 образуется продукт голубого цвета. Если чужеродная ДНК встроена в сайт рестрикции внутри гена, то ген не будет работать. Поэтому, если бакгерии, которые выросли в присутствии антибиотика, выращивать затем на среде с Х- а1, то колонии, не содержащие донорной ДНК, будут окрашены в голубой цвет. Бактерии же, образующие бесцветные колонии, содержат донорную ДНК, [c.224]

Мультилокусные зонды дают наилучший результат при использовании чистой, беспримесной ДНК. Однако судебные медики редко работают на свежем материале хорошего качества. Как правило, образцы чем-то загрязнены, например почвой или бактериями. Часто требуется более мощный метод. Этого достигают с помощью однолокусного зонда. Такой зонд можно использовать при работе с небольшими участками ДНК (например, с частично разрушенной ДНК), а также с малым количеством материала. Зонд распознает лишь одиночную короткую повторяющуюся последовательность, которая уникальна для одного минисателлита и поэтому обнаруживается только на определенной паре гомологичных хромосом. При рестрикции образуются два характерных фрагмента для каждого индивидуума, и, следовательно, на радиоавтографе появятся две полосы, одна материнского и одна отцовского происхождения (рис. 25.35). Если используют два однолокусных зонда, то появится четыре полосы если три, то — шесть, и т. д. Если требуется очень высокая достоверность в определении различий между двумя индивидуумами, то нужно использовать большое количество зондов (см. ниже). Этот метод называют генотипи-рованием, а получаемый при этом профиль используют в судебной экспертизе чаще всего. [c.266]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология