Химотрипсин с нитрофенилацетатом

Рис. 61. Кинетика образования л-нитрофенола в реакции гидролиза п-нитрофенилацетата, катализируемой а-химотрипсином [20]. (Концентрация фермента в случае а в два раза меньше, чем в случае б)

Рис. 110. Профиль рН-зависимосги ацилирования а-химотрипсина п-нитрофенилацетатом кривая является теоретической для р/(а=6,85 рКь=9,04

Не вызывает сомнений, что катализ химотрипсином (как и многими другими ферментами) включает стадию образования комплекса (комплекса фермент — субстрат) и затем стадию разрыва связей. Исследование, проведенное на примере /г-нитрофенилацетата, позволяет предположить, что комплекс гидролизуется в две стадии. На первой стадии отщепляется л-нитрофенол и образуется ацетилированный химотрипсин, который затем реагирует с водой, что приводит к образованию уксусной кислоты, прежде чем сможет начаться гидролиз другой молекулы п-нитрофенилацетата. [c.130]

Использование синтетического субстрата п-нитрофенилацетата (рис. 9.1) позволяет определять активность химотрипсина колориметрическими методами, поскольку гидролиз -нитрофенилацетата приводит к образованию -нитрофенола, который в щелочной среде превращается в имеющий желтую окраску / -нитрофенолят-анион. [c.91]

В некоторых случаях ингибитор может подвергаться химическому превращению под действием фермента. Например, гг-нитрофенилацетат гидролизуется протеолитическим ферментом химотрипсином гидролиз происходит в две стадии (рис. 2.18). [c.86]

Рис. 2.18. Гидролиз л-нитрофенилацетата химотрипсином

На первом этапе -нитрофенилацетат присоединяется к химотрипсину, т.е. образуется фермент-субстратный (ES) комплекс [c.155]

После смешивания химотрипсина и п-нитрофенилацетата можно наблюдать две фазы образования -нитрофенола. [c.156]

Функциональные группы активного центра химотрипсина идентифицированы с помощью необратимых ингибиторов. Остаток Ser-195 был модифицирован диизопропилфторфосфатом и фенил-метилсульфофторидом, а остаток His-57 — К-тозил-Ь-фенилала-ннл-хлорметилкетоном <см, рнс. 89 и с- 171). Двухстадинность процесса химотрипсинового гидролиза была обнаружена при изучении кинетики гидролиза п-нитрофенилацетата. [c.197]

Возьмем, например, ферментативный гидролиз такого модельного субстрата, как п-нитрофенилацетат (НФАц) при действии химотрипсина (ХТр). В упрощенном виде механизм этой реакции [c.49]

В этой главе ранее было отмечено, что энзиматическая активность зависит от соотношения между молекулярными конфигурациями субстрата и энзима, а также от химического активирования расщепляемой связи. Как будет показано ниже, оба эти фактора играют роль при взаимодействии фосфорорганических соединений с холинэстеразами (Aldridge, 1953а, Ь) это, по-видимому, относится и к а-химотрипсину. Тот факт, что химотрипсин активирует соединения, столь далекие от типичных субстратов, как п-нитрофенилацетат и диэтил-п-нитрофенилфосфат, представляет собой исключительно яркий пример химического активирования. Было бы интересно получить сведения о таких аналогах типичных субстратов, которые представляли бы собой сложные эфиры фосфорной кислоты. [c.636]

Диксон и Нейрат [152] попытались непосредственно наблюдать образование N-ацилимидазольных производных при ацилировании химотрнпсина -нитрофенилацетатом. В отличие от первоначальных результатов [138] эти исследователи показали, что на стадии ацилирования можно наблюдать быстрое увеличение поглощения при 245 ммк, которое затем медленно убывает со временем. Зная, что N-ацетилимидазол имеет .ма. с при 245 ммк и е 3-10 , можно рассчитать, что увеличение поглощен11я обусловлено ацилированием примерно 0,4 моля имидазольных групп в 1 моле химотрипсина. Кроме того, найдено, что константа скорости первого порядка, вычисленная по убыванию поглощения при 245 ммк, близка к константе скорости деацилирования 6-хи-мотрипсина, измеренной по появлению ферментативной активности. Показано, что скорость восстановления ферментативной активности, в свою очередь, соответствует скорости деацилирования N-ацетилимидазола. Однако в настоящее время считают, что поглощение при 245 ммк не связано со стадией ацилирования, а характеризует физическое состояние белка [15, 161]. [c.281]

Поскольку ДФФ не является полным структурным аналогом нормальных субстратов этих ферментов, опасность присоединения метки не к активному центру, а к каким-то другим участкам молекулы фермента в этом случае, естественно, больше, нежели в случаях описанных выше. Однако скорость, стехиометрия и специфичность реакции присоединения ДФФ явно указывают, что метка действительно попадает в активный центр. Известно, например, что ДФФ специфически фосфорилирует один из двух остатков серина в химотрипсине. Химотрипсин может быть помечен и многими другими аналогичными агентами, в том числе и-нитрофенилацетатом, причем в каждом случае аципируется одна и та же гидроксильная группа серина, тогда как никакие другие группы не ацилируются. Во многих (хотя и не во всех) исследованных эстеразах и протеиназах ДФФ фосфорилирует гидроксильную группу только того серина, с К-концом которого связан либо аланин, либо глицин. Данные, характеризующие окружение реакционноспособного серина в некоторых белках, приведены в табл. 29. Из таблицы видно, что даже ферменты, сильно различающиеся по своей специфичности, могут иметь одинаковую последовательность аминокислот в участках, примыкающих к остатку серина, содержащему реакционноспособную гидроксильную группу. Это позволяет думать, что специфичность фермента и его способность ката- [c.198]

Активный центр химотрипсина может быть ковалентно помечен квазисубстратами, в том числе п-нитрофенилацетатом, диизонропилфторфос-фатом и неактивированным метиловым эфиром коричной кислоты. Опыты такого рода позволили прийти к заключению об образовании промежуточного продукта реакции — ацилфермента. [c.203]

У всех перечисленных ферментов гидроксильная группа серинового остатка является местом связывания ацильной группы. При изучении характера взаимодействия специфического парализатора ДФФ и химотрипсина были получены сведения о механизме действия активного центра последнего было найдено, что ацилфермент образуется как необходимый промежуточный продукт при взаимодействии фермента с субстратом. При действии химотрипсина, например на п-нитрофенилацетат, образуется ацильное производное фермента — ацетил-химотрипсин, а п-нит-рофенол освобождается. Поскольку он, в отличие от своего ацетата, интенсивно окрашен, то эту реакцию можно было детально исследовать фотометрически. [c.83]

Рис. 23. Кинетика образования п-нитрофенола в реакции гидролиза п-нитрофенилацетата под действием а-химотрипсина. Концентрация фермента, соответствующая кривой I, в два раза меньше, чем на кривой 2 (Hartley, Kilby, 1952)

Например, этому уравнению подчиняются экспериментальные данные работы (Sodetz, astellino, 1972), в которой исследовалась предстационарная кинетика действия плазминов. Аналогичные данные получены в работе Бендера и соавторов при изучении кинетики гидролиза л-нитрофенилацетата под действием а-химотрипсина. Эти факты говорят о том, что механизм катализа включает промежуточные соединения, предшествующие ацилированию [c.80]

Хартли и Килби [11] нашли, что химотрипсин катализирует гидролиз п-нитрофенилацетата. [c.331]

Изучение кинетики одновременного гидролиза и гид-роксиламинолиза ряда эфиров в присутствии химотрипсина позволило сделать вывод, что гидроксиламин (и по аналогии вода) связывается независимо от субстрата с активной областью фермента [381, 382]. Подобное же изучение кинетики одновременного гидролиза и мета-нолиза метилового эфира ацетил-1-фенилаланина также указало на независимую связь эфира и воды (или метанола) с поверхностью фермента [383]. Причиной связывания воды является образование водородных связей между молекулами воды и основными группами на поверхности фермента. Данные об увеличении скорости гидролиза п-нитрофенилацетата в водно-спиртовых растворах, аТализируемого а-химотрипсином, можно интерпретировать, исходя из различия в силе связывания разных спиртов [384]. Замечено, что увеличение скорости происходит в большей степени с увеличением длины боковой цепи и снижается с разветвлением цепи. Метанол ведет себя в этом отношении аномально, так как способен увеличивать скорость в большей степени, чем этанол этот факт объясняют большей способностью метанола к образованию водородных связей вследствие его большей кислотности. Общее увеличение скорости с удлинением бо1ковой цепи связывают с увеличением ван-дер ваальсова притяжения [384]. Возможной областью для образования водородных связей с косубстратами является любая основная группа на поверхности фермента, апример имидазольная группа гистидина, а также карбоксильная группа остатка аспарагиновой кислоты, причем, как было отмечено ранее, обе эти группы, по-видимому, связаны с активной областью фермента. Имидазол, связанный водородной связью с нуклеофильным [c.141]

Дальнейшие успехи в выяснении каталитического процесса были достигнуты при использовании в качестве субстрата для химотрипсина /г-нитрофенилацетата. В этой реакции Хартлей и Килби наблюдали быстрое отщепление одного моля п-нитрофенола на моль химотрипсина и затем медленную реакцию оставшегося субстрата 391, 392]. Согласно их описанию, эта каталитическая реакция состоит из двух различимых стадий, следующих за первоначальной адсорбцией, и таким образом весь процесс состоит из трех стадий уравнение (71)] [c.144]

Начальная быстрая реакция может быть исследована струйным методом. Применив этот метод, чтобы проследить как стадию реакции, предшествующую стационарному состоянию, так и стадию, соответствующую устойчивому состоянию, удалось показать, что кинетика реакции отвечает приведенной выше схеме 393]. Для первой стадии, заключающейся в быстрой адсорбции субстрата на ферменте, константа скорости (k ), по-видимому, больше, чем 10в секг моль . Для второй стадии — ацилирования фермента и одновременного освобождения л-нитрофенола (Pi)—константа равна 3 селг. Третья стадия состоит в отщеплении ацетата (Рг)и реактивации фермента, причем константа скорости равна 0,0254 се " [393]. При использовании в качестве субстратов /г-нитрофенилацетата и 2,4-динитрофенилацетата было найдено, что константа скорости реакции 2 и Аз зависит от pH, причем h зависит от группы с кажущейся константой ионизации 6,7, а Аз зависит от группы с кажущейся константой ионизации 7,3 389] или 7,4 (377]. При pH 6,6 фермент в целом переносит от буфера на ацилирование химотрипсина /г-нитрофенил-ацетатом 0,5 протона (389]. Если бы имидазольная группа заметно ацилировалась, то при этом значении pH можно было бы ожидать отщепления протонов под действием фермента. [c.144]

Параллельно этим кинетическим исследованиям в некоторых важных препаративных работах было показано, что при низких значениях pH удается выделить устойчивое моноацетильное производное химотрипсина [395, 396]. Это моноацетильное производное является промежуточным соединением [FerS в уравнении (71)], образующимся при каталитическом разложении п-нитрофенилацетата химотрипсином. Оно не проявляет ферментативной активности, но легко отщепляет ацетильную группу. Ацетил-химотрипсин реагирует с водой, образуя уксусную кислоту, а со спиртами (предпочтительно с первичными)— даже в разбавленных водно-спиртовых растворах— образует соответствующие эфиры уксусной кислоты [397]. В обоих случаях ферментативная активность восстанавливается количественно- Было приготовлено [c.145]

Скорости ацилирования и деацилирования в систелшх, включающих имидазол и химотрипсин с п-нитрофенилацетатом [c.153]

Влияние гидрофобности уходящей группы на катал 13 химотрипсином гидролиза алкилацетатов было исследовано в реакции переносе ацетильной группы на спирты в процессе гидролиза гг-нитрофенилацетата [20и6]. Было показано, что скорость переноса коррелирует с гидрофобностью с угловым коэффициентом, близким к единице, лишь для ограниченного числа спиртов (от этанола до бу-танола). Другие спирты подчиняются в этой реакции ковреляционнчм завис шос тям с другими угловыми коэффициентами (см. также [2007]). [c.183]

Определение по связыванию профлавина (7), начальной скорости гидролиза Н-сукцинил-1 -фенилаланил-п-нитроанилида (в условиях [8] [Е] ) (2 , начальной скорости гидролиза п-нитрофенилацетата чЗ), изменению величины впадины на кривой ДОВ химотрипсина при 233 нм (4) [c.233]

Рис. 9.2. Кинетика освобождения п-нитрофснолят-аниона в ходе гидролиза и-нитрофенилацетата химотрипсином. регистрируемая методом остановленной струи. Количество выделившегося -нитрофенола определяется путем измерения оптической плотности.

Одним из первых ферментов, для которого было показано образование ковалентного фермент-субстратного интермедиата, является химотрипсин при действии этого фермента на п-нитрофе-нилацетат происходит быстрое освобождение п-нитрофенола и последующее значительно более медленное освобождение ацетата. Наблюдаемую кинетику процесса удалось объяснить, когда был выделен и охарактеризован ацилферментный интермедиат, устойчивый при низких pH. Установлено, что ацетилирование происходит по гидроксидной группе серина-195 фермента. Таким образом, гидролиз п-нитрофенилацетата протекает по крайней мере в три стадии [c.294]

Например, химотрипсин реагирует с п-нитрофенилацетатом (АсОЫр) в соответствии с вышеприведенной схемой (когда для первой стадии [АсОЫр] образованием промежуточного соединения ацилфермента (ЕАс) [c.143]

В 1954 г. Хартли и Килби при исследовании реакции между химотрипсином, взятом в количестве, сравнимом с количеством субстрата, и избытком п-нитрофенилацетата или п-нитрофенил-этилкарбоната 11], обнаружили, что экстраполяция количества высвобождающегося п-нитрофенола к нулевому моменту времени дает не нулевое количество этого соединения, а указывает на наличие всплеска, амплитуда которого равна концентрации фермента (рис. 4.10). Они постулировали, что сначала эфир быстро ацилирует фермент в соотношении 1 1, а затем в ходе последующего превращения субстрата идет относительно медленный гидролиз ацилфермента — стадия, являющаяся лимитирующей. Впоследствии это предположение было подтверждено в ходе исследований с применением метода остановленной струи. [c.214]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология