Препарирование срезов

Современные электронные микроскопы обладают высокой разрешающей способностью, однако успех исследования с помощью электронного микроскопа определяется не только качеством прибора, но и качеством приготовленного препарата. При выборе техники препарирования объектов следует прежде всего учитывать специфические условия, в которых находится объект в электронном микроскопе высокий вакуум, нагревание и ионизацию объекта под воздействием пучка электронов с энергией 50—100 кэВ. Необходимо считаться и с ограниченной проницаемостью объекта для электронов. Срез толщиной в несколько микрон, полученный с помощью обычного микротома, является уже непрозрачным при скоростях электронов, обычно используемых в современных микроскопах. Для наблюдения объекта в электронном микроскопе толщина среза не должна превышать 600—1000 А. [c.175]

В настоящее время имеется много надежных биохимических и механических методов, которые дают возможность изолировать отдельные клетки и органеллы. Эти методы не будут обсуждаться, но будет рассмотрено, как такие клетки и фрагменты тканей можно изучать в рентгеновском микроанализаторе. В качестве примера плодотворного исследования одиночной клетки служит рис. 12.2, на котором представлены результаты исследований и анализа клеток спермы человека в электронном микроскопе-микроанализаторе [208]. В некоторых отношениях изолированные клетки и органеллы, толщина которых составляет всего лишь несколько микрон, можно рассматривать как самостоятельный объект исследования, но их чрезвычайная мягкость и высокое содержание воды налагают серьезные ограничения на возможные используемые способы препарирования. В зависимости от их размера изолированные клетки и органеллы, а по этой причине неорганические материалы в виде частиц для аналитических целей могут рассматриваться либо как массивные образцы, либо как срезы. Некоторые примеры препарирования изолированных клеток приведены в недавно опубликованных работах [392, 393]. [c.271]

Толстые срезы (т. е. между 0,2 и 2,0 мкм) являются полез-ным компромиссом, поскольку при использовании растровых изображений на просвет может быть получена достаточно хорошая морфологическая информация, а образцы являются довольно толстыми и содержат достаточное количество материала, который можно проанализировать с хорошим пространственным разрешением. Поскольку большинство растительных и животных тканей являются очень мягкими, перед изготовлением срезов их прежде всего нужно стабилизировать и упрочнить. Как будет обсуждаться ниже, большинство из этих способов препарирования может привести к серьезным потерям из тканей растворимых субстанций и должно использоваться с большой осторожностью. Альтернативный путь — производить анализ срезов, высушенных лиофильной сушкой или замороженных в гидратированном состоянии. [c.273]

На тонких срезах толщиной менее 200 нм обычно обнаруживается огромное количество морфологических деталей, и им потенциально присуще самое высокое пространственное разрешение в режиме рентгеновского микроанализа. Однако за счет их малой толщины количество анализируемого материала может уменьшиться до очень низкого уровня вследствие малости микрообъема исследуемого среза. Тем не менее исследователь сталкивается с теми же проблемами препарирования, которые существуют при препарировании толстых срезов, и единственную заметную помощь дает использование тонких срезов материала, который подвергался лиофильной сушке или замораживанию замещением. [c.273]

В качестве альтернативы химической фиксации существует горячая фиксация. Клетки или тонкие срезы ткани помещаются на подходящую подложку, освобождаются от избыточной жидкости, а затем помещаются в пламя газовой горелки. Такая драконовская мера хотя и является разрушающей и вызывает морфологическое изменение и химическое перераспределение, тем не менее использовалась для успешного препарирования образцов для рентгеновского микроанализа. [c.280]

Большинство фиксированных и обезвоженных биологических тканей необходимо заливать либо смолой, либо парафином, чтобы иметь возможность изготовить срезы. Смола, однако, существенно разбавляет содержимое клеток, увеличивая общую массу образца. Этот этап в процедуре препарирования можно опустить, если должны исследоваться очень тонкие образцы или хорошие суспензии либо если образцы должны исследоваться в отраженных фотонах или электронах. [c.284]

Другими процедурами препарирования образцов для РЭМ, чем нанесение покрытий, которое обсуждалось в гл. 11, обычно не пользуются для анализируемых тканей. Работа при низком ускоряющем напряжении с целью уменьшения эффекта зарядки не находит применения в практике рентгеновского микроанализа, так как требуется выполнять условие, чтобы ускоряющее напряжение было примерно в три раза больше, чем критический потенциал возбуждения анализируемого элемента. Большинство приборов, в которых анализируются срезы, работает при 20—50 кВ. Инфильтрация образца такими химикатами, как [c.286]

При условии, что микроскоп или рентгеновский микроанализатор оснащены приставкой для охлал<дения, в нем можно исследовать и анализировать массивные образцы и срезы, в которых некоторая часть или вся вода находится в твердом состоянии. Эти исследования связаны с большими техническими трудностями, не последней из которых является уверенность в том, что образец остается в замороженном из гидратированного состояния в незагрязненном виде в течение всего процесса препарирования и проведения исследований. Объем книги не позволяет подробно обсудить эти методики, поэтому мы даем [c.294]

Замораживание-замещение является полезным методом препарирования образцов для получения тонких срезов. Несмотря на то что основное усилие исследований было направлено на защиту морфологической целостности образцов, в настоящее время имеется достаточно оснований, чтобы предполагать, что замораживание-замещение может также быть полезным методом препарирования для микроанализа биологических объектов. Мы отправляем читателя к недавно опубликованным обзорам [453, 454], в которых обсуждается целый ряд методов в применении для растительных и животных тканей. [c.302]

Если проводится исследование замороженных в гидратированном состоянии образцов, то необходимо вносить срезы в микроанализатор в состоянии, когда есть уверенность, что они не утеряли воду (за счет плавления или сублимации) и не накопили ее (за счет конденсации из загрязненной атмосферы). Был разработан целый ряд переносных устройств, и все они служат одной и той же цели — сохранить образец холодным ( 123 К) и не загрязненным. В работе [473] была разработана полезная и простая методика, в которой образцы до препарирования и переноса заключались в формваровый контейнер. [c.316]

Наконец, важно рассмотреть сложный вопрос, остается ли замороженный в гидратированном состоянии образец в таком же состоянии во время препарирования, исследования и анализа. В работах [465, 300, 277, 201] был предложен целый ряд критериев, которые могли бы быть полезными в определении того, остается ли образец замороженным в гидратированном состоянии во время анализа. В работах [304, 474, 475] было показано, что тонкие срезы не плавятся под электронным пучком, что является доказательством того, что они остаются достаточно холодными. Все эти критерии, по-видимому, не могут быть применимыми во всех условиях. [c.316]

В целом метод ультратонких срезов следует рассматривать как ценное дополнение к арсеналу имеющихся методов препарирования, а при его применении руководствоваться общим правилом при исследовании новых препаратов применять различные методы и па основании общих соображений и опытных данных определять наиболее эффективные из них. [c.121]

Структура окисных катализаторов была изучена также Рубинштейном, Дашевским и Прибытковой [65] при помощи метода ультратонких срезов. В смешанном N10 — АЬОз-ката-лизаторе, приготовленном совместным осаждением гидроокисей, их высушиванием и прокаливанием, отчетливо наблюдались хорошо образованные кристаллики размером в несколько сотен ангстрем. Возникновение кристалликов в этом случае легко понять, если принять во внимание высокую температуру обработки катализатора. Аналогичные результаты были получены также Бахманом и Кремером [66] при изучении тем же методом катализаторов на основе окисей магния и никеля. Эти данные свидетельствуют о том, что метод ультратонких срезов вполне пригоден для исследования структуры высокодисперсных тел, во всяком случае некоторых их типов, и является ценным дополнением к применявшимся ранее способам препарирования. [c.150]

Метод оптической микроскопии обычно не требует специального препарирования исследуемых объектов. Наиболее удобны для изучения в проходящем свете образцы в виде тонких пленок или срезов с массивных блоков, толщина которых может колебаться от нескольких до сотен микрон. Оптическая микроскопия в отраженном свете широко используется для исследования структуры поверхности массивных полимерных материалов, а также поверхностей разлома. [c.76]

Однако сам факт препарирования для получения срезов толщиной менее 10 А может привести к частичному разрушению исходной поликристаллической структуры. Кроме того, весьма трудно сохранить нужную температуру в срезе после его получения. [c.66]

Исследования косых срезов и препарированных участков окалины показали, что в большинстве случаев образуется многослойная окалина, внутренние слои которой состоят из низших окислов (Т10, 2гО, 0.2). Наличие сравнительно толстых прослоек этих окислов в окалине боридов свидетельствует о пониженном парциальном давлении кислорода во внутренних слоях окалины. [c.71]

Работа со свежими срезами ие гарантирует химической чистоты поверхности, потому что реакции, изменяющие поверхность, наиболее активно идут при механическом воздействии на образец либо при повышении температуры образца до комнатной при его препарировании. — (Прим. ред.) [c.386]

Приготовление образцов для проведения этих исследований осуществляется по схеме, представленной на рис. 7.1. Она включает стадии, типичные для приготовления и разрушения реальных адгезионных соединений дублирование адгезива с субстратом, отжиг системы, отслаивание адгезива от субстрата путем введения в надрез клина. Применение указанных физических методов локального исследования структуры, морфологии и элементного состава позволяет зарегистрировать на поверхности поперечного среза концентрационное распределение компонентов в зоне адгезионного соединения, определить наличие и пространственное расположение межфазной границы, идентифицировать место прорастания трещины, установить характер разрушения [380, 386]. С помощью этой информации можно определить фазовые характеристики системы, измерить коэффициенты взаимодиффузии и размеры диффузионной зоны, описать переходную область и выявить ее слабое место . Накопленный в настоящее время опыт препарирования металл — полимерных и многослойных систем с применением криогенных ультрамикротомов, снабженных алмазными ножами, показывает, что эта схема препарирования без особого изменения может быть использована и при исследовании реальных адгезионных соединений. [c.255]

Кроме того, необходимо всегда учитывать возможность искажения истинной картины из-за возникновения артефактов при препарировании образца. Например, при получении тонких слоев (срезов) волокон наложение внешнего силового поля (воздействие режущего инструмента) на поле внутренних напряжений, сохранившихся в волокне, может дать отражение этих напряжений, а не истинную картину надмолекулярной структуры полимера в волокне. [c.238]

Внутреннее содержимое может быть обнаружено в большей или меньшей степени на любой стадии процесса препарирования даже в микроскопе с помощью микродиссекции. Однако большинство биологических тканей являются очень мягкими, и более общепринято получение срезов и изломов после стабилизации и обезвоживания. [c.231]

Из-за трудности препарирования образцов метод электронной микроскопии далеко не всегда может быть использован для анализа полимерных систем [59, 60]. Для рассматриваемых в настоящей работе сополимеров бутадиена и стирола легко осуществить контрастирование полибутадиеновой фазы с помощью 0364 [41]. Тонкие пленки толщиной в несколько десятков микрон отливают из разбавленных растворов и помещают в пары водного раствора 0з04. Аналогичной обработке подвергают тонкие срезы макроскопических образцов. Если представляет интерес морфологическая структура в плоскостях, перпендикулярных к поверхности пленки, такую пленку заделывают в материал одинаковой с ней твердости, в кото- [c.182]

Как и любой другой метод препарирования, метод тонких срезов имеет свои преимущества и недостатки. Достоинством его является возможность непосредственно наблюдать структуру не только поверхностных, но и внутренних слоев препаратов, если последовательно изучать срезы различных по глубине участков. При этом удается различать детали структуры, размеры которых составляют не менее /ю толщины среза. Это давно установленное эмпирическое правило было теоретически объяснено Косслеттом [174], принявшим во внимание потерю энергии электронами, рассеянными в образце, и хроматическую аберрацию объективных линз. Автор указывает, что невысокое разрешение в этом случае объясняется недостаточным контрастом. [c.120]

В заключение рассмотрим работы, авторы которых применили другие методы препарирования и смогли расширить возможности электронно-микроскопического исследования высокодиснерсных минералов. При помощи метода ультратонких срезов было показано, что отдельные частицы глауконита часто образуют дендритообразные агрегаты, входящие в состав плотной сетчатой структуры, в которой встречаются пустоты характерной формы [82, 83]. После фиксирования в полимере осадка суспензии каолинита на срезах можно видеть, как были агрегированы частицы в осадке. Этот прием нозволяет исследовать ориентацию частиц в осадках глинистых и других минералов. [c.226]

Более надежные результаты дает сухое препарирование, предложенное Лукьяновичем и Радушкевичем 8]. Путем раскалывания зерен углей авторам удавалось получать тонкие клиновидные пластинки, на краях которых можно было наблюдать сохранившуюся структуру. В сахарных углях в согласии с адсорбционной характеристикой была отмечена сильно развитая переходная пористость с размерами пор порядка 100 А (фото 75). К числу основных недостатков способа раскалывания, равно как и метода ультратонких срезов применительно к изучению активных углей, относится невысокая контрастность изображения, что не позволяет получить на микрофотографиях наилучшего разрешения, возможного для микроскопа. Кроме того, возникает сложный вопрос о том, в какой степени проявляется эффект взаимного наложения изоб1ражений пор, находящихся в различных плоскостях угольной пластинки или среза. [c.241]

Большинство исследователей, к сожалению, к этому вопросу редко обращаются заново, хотя разрешающая способность электронных микроскопов достигла предела (2 А), а при препарировании возможно напылять бесструктурные конденсаты [ 2], использовать негативное контрастирование [9] весьма совершенной стала техника микротомирования, вплоть до возможного получения срезов с замороженных препаратов и т. д. [c.88]

Для исследования блоков полимеров важен метод ультратонких срезов — ультрамикротоми-р о в а и и е, широко применяемое в биологии. Препарирование в этом случае заключается в срезывании с блока полимера очень тонкого слоя (толщиной ок. 50 нм, или 500 А) с помощью специальных приборов — ультрамикротомов. Однако при ультрамикротомиро-вании кристаллизующихся полимеров возможны значительные смятия и искажения структуры препаратов, т. наз. артефакты, к-рые можно ошибочно интерпретировать как элементы надмолекулярной структуры полимеров. Возникновения многих артефактов удается избежать при ультрамикротомировании замороженных образцов. [c.475]

Одной из самых больших трудностей электронно-микроскопического метода исследования студней является сложность препарирования объектов. Легкая деформируемость студней, модуль упругости которых очень низок, не позволяет получать срезы малой толщины, пригодные для просвечивающей электронной микроскопии (менее 1000А). Растворители приходится удалять из системы путем высушивания образца или последовательного вытеснения нерастворителями. В первом случае возможно смыкание элементов структуры [c.102]

С этой точки зрения интересно рассмотреть результаты окисления борида циркония. По мере увеличения времени окисления цвет поверхности образца изменяется от иссиня-черного, через мутно-черный и серый, к серо-белому. Одновременно характер поверхности изменяется от совершенно гладкой глянцевой ( лаковой ) к матовой. При исследовании поперечных и косых срезов окалины (рис. 8) и препарированных участков отчетлцво обнаруживается черная прослойка между боридной основой и толстым [c.71]

Описанные выше способы приготовления пленок имеют тот [едостаток, что при препарировании может изменяться структу-)а исследуемого полимера. Избавиться от этого недостатка позволяет метод тонких срезов. Его применяют в тех случаях, ког-[,а невозможно расплавить или растворить полимер без его азрушения, например при исследовании сшитых смол, эласто-1еров. [c.63]

В ряде работ толщину термопластичных волокон уменьшали вальцеванием или прессованием. Однако такая методика препарирования пригодна лишь для качественных исследований, так как структура полимера и ориентация его молекул при этом изменяются. Различные ориентационные эффекты, являющиеся на самом деле артефактами, проявляются также и при неправильном получении продольных срезов. Этим был объяснен [230] наблюдаемый [1377] параллельный дихроизм КН- и СН-валент-ных колебаний в слегка растянутых волокнах найлона-66. Ориентирование исчезало, или по крайней мере, снижалось если волокно перед микротомированием погружали в полиметилметакри-лат, пластифицированный полиэтиленгликолем, и таким способом выравнивали консистенции матрицы и волокна [826]. [c.72]

При разложении древесины мицеллярная структура в основном сохраняется. Полосчатость видна более отчетливо и полосы оказываются более раздвинутыми. Для установления сходства между мицеллярной структурой целлюлозы и лигнина первая удалялась обработкой сосновой древесины реактивом Швейцера. Структура срезов препарированной таким образом древесины имела сходство со структурой срезов сильно разложившейся хвойной древесины. После обработки древесины реактивом Шве 1цера структура лиг ина сохраняется такой же [c.17]

Например, образование поперечных штрихов на срезах продольно ориентированных вискозных волокон (см. рис. 10.7) не обязательно должно быть истолковано как отражение тонкой структуры целлюлозного волокна Они могут быть вызваны поверхностным разрушением полимера при одновременном влиянии релаксации впутреиних напряжений, сохранившихся в волокне при его препарировании. [c.240]

Есть два обстоятельства, тормозящие исследование клеточной стенк при помощи электронного микроскопа. Первое состоит в том, что срезы должны быть высокой степени тонкости, которую не легко достигнуть обыкновенным микротомом (0,1 [X или меньше) второе — в том, что всякий рассматриваемый материал должен быть полностью обезвожен. Сейчас изготовляют специальные скоростные микротомы, способные отрезать срезы требуемой тонкости [61, 62]. Однако большинство исследований с электронным микроскопом проводилось на мельчайших срезах химически препарированных, размолотых в ролле волокон, в результате чего достигалось фи-бриллирование (рис. 16). Хотя внешний вид высушенного материала мог сильно измениться, можно все-таки утверждать, что, даже при наибольших достигнутых увеличениях (в 25000—50000 раз и более), клеточная стенка имеет волокнистое строение. Как было показано Сирсом и Крегелем [63] и др., стенки состоят из все более и более тонких фибрилл или субфибрилл до пределов разрешающей способности электронного микроскопа. Очевидно, что картина не оставляет. места для фактического существования в качестве структурных элементов клеточной стенки крупных основных единиц , хотя их и можно наблюдать в оптический микроскоп. [c.99]

При наблюдении в световой микроскоп ткань благодаря контрастирующему красителю выглядит красной, а включения железа - интенсивно синими. Если все операции проводят очень тщательно (используют бидистиллят, очищают все стекла, сосуды для окрашивания и т.д.), то поверхностных артефактов мало. Поскольку железо-широко распространенный элемент и у позвоночных оно участвует в дыхании, его выявление в данной ткани еще не означает, что оно всегда в ней имеется. Очевидно, если железо участвует в сенсорном процессе, то оно должно всегда присутствовать в магниторецепторной системе. Исходя из этого, мы установили следующий критерий положительного окрашивания на железо. Окрашивание должно обнаруживаться в одних и тех же клетках, по крайней мере в десяти последовательных срезах, и в одних и тех же клетках определенной ткани по меньшей мере у пяти различных животных. Позитивное окрашивание при использовании этой методики не доказывает, что обнаружен магнетит, но оно свидетельствует о присутствии железа и его локализации в ткани. Железо, связанное с белками, например в гемоглобине или цитохромных ферментах, никогда не окрашивается. Этот вывод был сделан при попытке окрасить эритроциты голубя или митохондрии в исследуемых тканях. Частицы магнетита окрашиваются так же, как и любые сплавы металлического железа, поэтому в процессе препарирования и окрашивания тканей нельзя использовать никакие инструменты, содержащие железо. Мы наблюдали окрашивание селезенки голубя, которая содержит железо, отщепившееся от гемоглобина. У пчелы (Kuterba h et al., 1982), большая часть железных гранул представлена гидратом оксида железа, например в составе ферритина, и интенсивно окрашивается. Итак, окрашивание ферроцианидом калия является первым шагом при изучении железосодержащих тканей. Эта методика показывает, какие ткани и клетки содержат железо, а также позволяет установить, распределено ли оно диффузно или присутствует в виде гранул. [c.249]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология