Методы изучения последовательности ферментативных реакций

Шестой случай буфер с заданными значениями pH и ионной силы, при выполнении ряда экспериментов, например при электрофоретических исследованиях или при изучении кинетики ферментативных реакций, возникает необходимость в буфере с определенным значением pH при заданном значении ионной силы. Мы можем подбирать такой буфер или путем последовательных приближений, используя метод проб и ошибок, или путем добавления КС1 к буферу с нужным значением pH до [c.232]

Как уже указывалось, любая ферментативная реакция представляет собой цепь последовательных процессов, каждое звено которой характеризуется собственной константой скорости, значениями энергии активации и пространственного фактора. Поэтому, определяя экспериментально стационарную скорость ферментативной реакции при разных температурах и вычисляя по этим данным энергии активации, исследователь часто получает фиктивную величину — значение кажущейся энергии активации, которое трудно отнести к какой-то определенной стадии реакции. По этим причинам при изучении температурной зависимости результирующей скорости ферментативного процесса оказывается невозможным вычисление предэкспоненциального множителя и пространственного фактора. Все это приводит к настоятельной необходимости разработки специальных методов ферментативной кинетики, позволяющих вычислять константы скорости отдельных стадий процесса и на основе изучения их зависимости от температуры рассчитывать другие кинетические константы. [c.24]

Однако в большинстве случаев ферментативный процесс представляет собой комплекс ряда таких реакций, протекающих последовательно (а частью может быть и параллельно). Детальное изучение кинетики таких реакций потребовало разработки новых экспериментальных методов исследования. - Результаты работ И. В. Березина и других показали, что кинетическое изучение многостадийной каталитической реакции дает возможность глубже раскрыть механизм ферментативного процесса [c.671]

В последнее время работами Хесса с сотрудниками [5—7] на примере а-химотрипсина был развит новый метод изучения кинетики начальных стадий ферментативных реакций, получивший название метода вытеснения профлавина . Метод основан на том факте, что краситель профлавин (3,6-диаминоакридин) при связывании с а-химотрипсином в водном растворе изменяет свой спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Величина разностного спектра поглощения, имеющего максимальное значение при длине волны 465 нм, пропорциональна -концентрации комплекса фермент-профлавин. Введение в систему фермент-профлавин субстрата, конкурирующего с красителем за связывание на активном центре а-химотрипсина, приводит к двум последовательным процессам вытеснения профлавина. Первый, очень быстрый процесс, заключается в обратимом вытеснении красителя из комплекса его с ферментом за счет образования нековалентного фермент-субстратного комплекса. Второй процесс, времена прохождения которого лежат обычно в пределах разрешения установок типа остановленной струи , вызван химическим взаимодействием субстрата с ферментом (например, образованием ацилферментного промежуточного соединения), что приводит к дополнительному уменьшению концентрации комплекса фермент-профлавин. Изучение кинетики второго процесса при различных концентрациях субстрата в дополнение к изучению кинетики ферментативной реакции в стационарном режиме позволяет сделать заключения о стадийности изучаемой реакции, а также найти значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативной реакции. [c.188]

Реакции в полиферментных системах с кинетической точки зрения можно рассматривать как последовательные процессы, специфической особенностью которых является катализ ферментами каждой из стадий реакции. Определенные успехи в настоящее время существуют в кинетическом описании и математическом моделировании реакций в полиферментных системах. Большую роль в этом играют методы качественного анализа систем нелинейных дифференциальных уравнений, описывающих кинетику сложных реакций (Иваницкий, Сельков, Кринский, 1978). В последние годы определенное развитие получили методы конкретного детального расчета кинетики процессов на основе подходов, разработанных при изучении отдельных ферментативных реакций. [c.170]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

Все это показывает, как широко используется ультрацентрифугирование при изучении нуклеиновых кислот и биосинтеза белка. Ультрацентрифугирование незаменимо также при все более расширяющемся изучении смежных проблем — в частности при изучении механизмов регуляции ферментативных реакций. Метаболические потребности клетки удовлетворяются, как известно, благодаря тонкой согласованности скоростей различных биохимических последовательностей. Такая согласованность возможна благодаря чувствительности аллостерических ферментов к изменениям концентраций отдельных метаболитов, что в свою очередь зависит от конформационных изменений, вызываемых соответствующим метаболитом и, очевидно, передающихся путем взаимодействия субъединиц ферментного белка. Успехи, достигнутые в изучении свойств аллостериче-ского фермента — аспартат-карбамоилтрансферазы, хорошо иллюстрируют большое значение ультрацентрифугирования — особенно когда оно используется в сочетании с другими методами анализа. Так, Герхарт и Шахман [5] показали, что этот фермент, представляющий собой глобулярный белок с молекулярной массой около 3-10 , после обработки соединениями ртути распадается на субъединицы двух типов. Каталитической активностью обладают лишь субъединицы одного типа, в субъединицах же другого типа, не обладающих каталитической активностью, находится центр по которому происходит присоединение цитидинтрифосфата. С этой регуляторной субъединицей связывается 5-бромцитидин-трифосфат, о чем свидетельствует соответствующая картина седиментации. Позже Вебер [6] определил аминокислотный состав и Ы-концевые остатки субъединиц обоих типов и установил, что одна молекула фермента содержит четыре регуляторных и четыре каталитических субъединицы. [c.9]

Успехи, достигнутые с помощью различных экспериментальных подходов в изучении гликолиза, показывают, что прогресс в выяснении метаболических процессов зависит от развития методов, с помощью которых биохимические лоследовательности можно расчленить на отдельные звенья. Конечной целью такого подхода является выделение и кристаллизация ферментов, катализирующих каждую отдельную реакцию. Необходимость применения этих методов вытекает из наличия чрезвычайно сложного переплетения ферментативных процессов. Но именно это обстоятельство и создает парадоксальную ситуацию поскольку различные метаболические последовательности связаны друг с другом, функционирование любой из них может зависеть от остальных. Это значит, что мы не сможем полностью оценить физиологической роли [c.16]

Кинетические аспекты. Трудно представить, что белки могут принимать нативную физиологически активную конформацию, сворачиваясь случайным образом по принципу "проб и ошибок". Даже в условиях in vitro самопроизвольная сборка трехмерной структуры белка, не содержащего дисульфидных мостиков, происходит настолько быстро, что дает основание допустить во много раз большую скорость этого же процесса в условиях in vivo по сравнению со скоростью рибосомального матричного синтеза аминокислотной последовательности. Создание за считанные секунды из развернутой полипептидной цепи трехмерной структуры макромолекулы возможно только при высокой степени кооперативности процесса. Естественно было ожидать, что кинетика этого процесса будет соответствовать такому механизму ренатурации белка, при котором происходящие на каждом участке последовательности события увеличивают вероятность и, следовательно, скорость последующей укладки всех отдельных участков цепи в направлении правильной нативной конформации. Данному условию удовлетворяет самый простой механизм самоорганизации белков, включающий единственный переход между двумя состояниями (N D). Согласно теории этого процесса, которая только что была рассмотрена, никакие другие состояния белковой цепи, кроме N и D, не присутствуют в экспериментально обнаруживаемых количествах в течение всего времени прямой (N -> D) и обратной (N D) реакций. Если развертывание и свертывание белковой цепи действительно следуют двухстадийному процессу, то изучение кинетики и выяснение деталей конкретного механизма денатурации и ренатурации сталкивается с особенно серьезными трудностями. Они вызваны большими скоростями реакции и малыми концентрациями промежуточных состояний, а это требует быстрореагирующей и высокочувствительной экспериментальной техники. Наиболее часто используются спектральные методы (ЯМР, КД, УФ), ферментативный гидролиз, иммунологические методы. Для быстрой остановки процесса применяются методы стоп-флоу. [c.352]