Нуклеиновые кислоты, гибриды

Разделение различных фракций РНК, ДНК и их гибридов основано на различии в прочности сорбции одно- и двухнитевых молекул нуклеиновых кислот прочность сорбции фрагментов нуклеиновых кислот повышается с увеличением их длины. Десорбция вызывается увеличением концентрации фосфатного буфера. [c.171]

Необычайный интерес в последние годы вызвали РНК-содержащие онкогенные вирусы. Большинство исследователей, занимающиеся биохимической генетикой и функциями нуклеиновых кислот, считали, что ДНК образуется только за счет репликации других молекул ДНК- Если транскрибирование РНК с ДНК может протекать свободно, то обратный процесс, а именно образование ДНК на РНК-матрице, считался маловероятным. Большой неожиданностью поэтому оказалось обнаружение во многих онкогенных РНК-содержащих вирусах, и в том числе в вирусах, вызывающих у животных лейкоз, РНК-зави-симой ДНК-полимеразы (т.е. обратной транскриптазы). Этот фермент обнаруживается в зрелых вирусных частицах. Наиболее тщательно очищенный фермент вирусов миелобластоза птиц состоит из двух белковых субъединиц, имеющих мол. вес ПО ООО и 70 000, и содержит два атома связанного Zn +. Для функционирования фермента необходима короткая затравка и матричная цепь РНК. При этом сначала получается гибрид ДНК—РНК, из которого затем (вероятно, после гидролитического расщепления цепи РНК под действием РНКазы Н, разд. Д, 5, в) получается двухцепочечная ДНК. Таким образом, заражение РНК-содержащими вирусами сопровождается образованием [c.288]

Современный уровень развития биотехнологии обусловлен общим прогрессом науки и техники, особенно — в течение последних 50 лет Достаточно отметить лишь такие события, как установление структуры и функций нуклеиновых кислот, обнаружение ферментов рестрикции ДНК и выявление их значения в жизни клеток с последующим использованием в генно-инженерных работах, создание гибридом и получение моноклональных антител, внедрение ЭВМ и компьютерной техники в биотехнологические процессы и т д [c.9]

Различие между белками этих двух штаммов состоит в том, что у подорожникового штамма белок содержит метионин и гистидин, отсутствующие в белке нормального штамма. Вирусы эти различаются по своим иммунологическим свойствам. Оказалось, что гибридный вирус вызывает заболевание, характерное для подорожникового штамма, по по иммунологическим свойствам напоминает обычный штамм. Потомство же гибридного вируса содержит метионин и гистидин, подобно белку подорожникового штамма, из которого первоначально была получена нуклеиновая кислота вируса, и в отличие от белка гибрида, использованного в качестве инокулума. Эти результаты доказывают, что генетические особенности вируса определяются его РНК, но не его белком. [c.154]

По своей сути генетика — наука пограничная. Классический генетический анализ основан на применении сугубо биологических методов скрещиваний, изучения потомства гибридов, а также изменчивости организмов. Выявляемая этими методами генетическая дискретность — не что иное, как отражение молекулярной дискретности в организации клеток и организмов, т. е. дискретности белков и нуклеиновых кислот. С одной стороны, это показывает пределы разрешающей способности генетического анализа (строго говоря, белки и нуклеиновые кислоты — предмет изучения биохимии), а с другой — объясняет неизбежность совместной разработки смежных областей. Отсюда необходимость в современном учебнике генетики экскурсов во многие пограничные дисциплины, особенно в молекулярную биологию. [c.3]

В заключение отметим, что мочевину нельзя отнести к числу агентов, сильно денатурирующих нуклеиновые кислоты. 6 М мочевина разрушает агрегаты, разворачивает, но не полностью денатурирует РНК, а достаточно комплементарная структура двунитевой ДНК или гибрида ДНК—РНК в ее присутствии сохраняется. [c.135]

После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и анализируют с помощью авторадиографии с использованием чувствительной к радиоактивному излучению рентгеновской пленки. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения исследования идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот. [c.163]

В предыдущем разделе мы рассмотрели счет радиоактивно меченных нуклеиновых кислот. Однако мембранные фильтры играют и другую важную роль в исследовании нуклеиновых кислот благодаря их способности избирательно связывать эти макромолекулы. Мембраны из нитрата (но не ацетата) целлюлозы связывают денатурированную ДНК и гибриды РНК/ДНК, пропуская в то же время свободную РНК. Согласно данным фирмы Миллипор , нитроцеллюлозные мембраны связывают однонитевую ДНК в количестве 50—80 мкг/см , в то время как ацетилцеллюлозные мембраны связывают только 1 мкг/см . Благодаря такому селективному связыванию нитроцеллюлозные мембраны можно использовать при изучении гибридизации нуклеиновых кислот. В самом деле, это уникальное свойство нитроцеллюлозных мембран сыграло важную роль в исследованиях, ведущих к развитию технологии рекомбинантных ДНК. [c.319]

Рестриктазы незаменимы в структурных исследованиях нуклеиновых кислот. В случае РНК достаточно специфическое расщепление ее цепи можно осуществить с помощью рибонуклеазы Н, гидролизующей полирибонуклеотиды только в ДНК — РИК-гибридах. Для этого с участком РНК, предназначенным для расщепления, предварительно связывают комплементарный ему олигодезоксири-бонуклеотид и обрабатывают образовавшийся комплекс РНК-азой Н (рнс. 4). [c.15]

Разумеется, без достаточных экспериментальных подтверждений мы не можем настаивать на таком объяснении, однако это и не так уже существенно. Важен надежно установленный экспериментальный факт для элюции нативной ДНК (или двунитевой РНК, а также гибридных молекул ДНК—РНК) с оксиапатита требуется почти вдвое более высокая концентрация фосфатного буфера, чем для элюции денатурированной ДНК или однонитевой РНК. Это обстоятельство открыло возможность быстрого и надежного отделения двунитевых молекул нуклеиновых кислот от однонитевых, что сыграло очень важную роль как в изучении структуры генома (исследования кинетики ренатурации), так и в развитии современных методов генной инженерии (гибридизация молекул НК и др.). Как и в случае кислых белков, присутствие даже относительно высоких концентраций неорганических солей в элюирующем буфере практически не сказывается на процессах элюции одно- и двунитевых молекул НК с оксиапатита. Вместе с тем, варьируя концентрацию Na l или КС1 в буфере, можно управлять изменением конформации самих нуклеиновых кислот, а также характером их гибридизации (например, отделять истинные , полноценные, гибридные молекулы от несовершенных гибридов ). [c.230]

Принцип метода иллюстрирует рис. 148. Фрагмент ДНК, по которому ведется отбор, например содержащий определенный ген, встраивают и размножают в плазмиде. Очищенные плазмиды дробят ультразвуком или линеаризируют действием рестриктаз, а затем меркурируют, как описано выше. Фрагментированные ДНК или РНК, из которых надлежит отобрать комплементарные участки, гибридизуют с ДНК меркурированных плазмид в условиях, когда последняя находится в избытке. Гибридные молекулы (вместе с молекулами ренатурпрованной плазмидной ДНК) вносят на колонку SH-сефарозы. При этом нити плазмидной ДНК через атомы ртути ковалентно связываются с сорбентом (на рис. 148 для ясности он изображен в виде ааштрихованных полосок у стенок колонки, тогда как в действительности он заполняет весь ее объем). Промывка колонки удаляет из нее не вошедшие в состав гибридов, т. е. пе комплементарные к плазмидной ДНК фрагменты нуклеиновых кислот. Затем следует элюция 97 %-ным формамидом нри повышенной темнературе. Двунитевые структуры диссоциируют, и очищенные комплементарные участки ДНК или РНК, не будучи связанными с матрицей, выходят из колонки. Остающуюся в колонке меркурированную плазмидную ДНК можно снять, как обычно, элюцией -меркаито-этанолом. [c.438]

Аффинная хроматография НК на сорбентах, лигандами которых являются тоже нуклеиновые кислоты, базируется на их комплементарном взаимодействии с образованием достаточно прочных двунитевых структур — двунитевых ДНК и РНК нли ДНК—РНК-гибридов. Такие структуры образуются и надежно сохраняются лишь тогда, когда строго комплементарные участки имеют протяженность в десятки нуклеотидных звеньев. Эта степень соответствия не может быть случайной, а реализуется только в том случае, когда одна из НК была синтезирована по матрице второй НК (или ей идентичной). Разумеется, как иммобилизованная НК, так и очищаемая должны быть однонитевыми, а условия связывания с сорбентом должны быть благоприятными для их гибридизации. [c.441]

Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или вьщеления нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образцы. Исследователи с успехом проводят гибриди- [c.188]

Нуклеиновые кислоты являются одним из наиболее сложных типов биополимеров. В природе встречаются двунитевые и од-нонитевые, циркулярные и сверхспиральные ДНК, рибосомаль-ные, информационные и транспортные РНК, гибриды РНК— ДНК. В процессе исследований приходится иметь дело с синтетическими монотонными или смещанными полинуклеотидами. Нуклеиновые кислоты всех типов являются полианионами даже при нейтральных значениях pH. Все эти факторы позволяют использовать при фракционировании все виды хроматографии ионообменную, адсорбционную, распределительную и гель-проникающую, а также все типы хроматографических сорбентов (см. табл. 38.2). [c.67]

Разделение вируса на два отдельных компонента позволило также соединять нуклеиновокислотный и белковый компоненты разных штаммов вируса табачной мозаики, имеющих различные свойства. В этих опытах было показано, что по своим свойствам эти необычные гибриды соответствовали Б основном тому штамму, от которого была взята нуклеиновая кислота, так что белки в данном случае имели второстепенное значение. [c.252]

Можно назвать множество примеров использования микрофильтрационных мембран в качестве фильтров для сбора частиц, подвергаемых затем анализу сбор бактерий для прямого подсчета с помощью микроскопа в прошедшем свете подсчет частиц в напитках подсчет фитопланктона измерение и подсчет инертных частиц подсчет асбестовых волокон, раковых клеток, адсорбция и элюирование вирусов и подсчет жизнеспособных водопереносимых бактерий [7]. Электрофорез является электрически управляемым процессом, в котором белковые фракции разделяются либо в микропористых ацетатцеллюлозных гелях [8], либо в ультрапористых агаровых или полиамидных гелях. Активному возбуждению гибридизации нуклеиновой кислоты помогает способность нитрата целлюлозы сильно сорбировать ДНК, поэтому и ДНК ДНК-, и ДНК РНК-гибриди-зации могут быть осуществлены на мембранном фильтре [7]. [c.85]

РНК давала после сплавления и отжига пик, лежавший близко к пику ДНК, но не совпадавший с ним. В том же месте оказывается некоторое количество ДНК, которое обнаруживается по метке Р . Стало быть, промежуточный пик, несупщй двойную радиоактивность Р и С ", относится к гибридам ДНК—ИРНК. Ряд контрольных наблюдений показал, что это явление — специфическое связывание. Простое смешение ДНК фага и ИРНК ничего не давало. Необходим был нагрев и последующий отжиг . Замена ДНК фага Tj на ДНК фага Tj обнаружила нулевой эффект, т. е. показала специфичность связывания обоих полимеров. Хотя средний состав цепей ДНК у обоих фагов близок, все же гибридизации цепей не происходило. Интересно, что ни РНК-аза, ни ДНК-аза, ни оба фермента вместе не способны атаковать двойные гибридные спирали ДНК—ИРНК. Хесин использовал эту особенность для выделения ИРНК фага путем сплавления с гомологической ДНК и последующего гидролиза нуклеиновых кислот обеими нуклеазами. [c.472]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Формамид является лучшим растворителем для снижения температур денатурации двухцепочечных комплексов ДНК и гибридов РНК — ДНК. При более низких температурах денатурации снижается степень термической деградации нуклеиновых кислот. В буферах, содержаш,их от 0,035 до 0,88 М Na I, на каждый процент формамида Тт ДНК снижается на 0,60 °С [34]. Для гибридизации рРНК на фильтре Джиллеспи и Джиллеспи [29] применяли 50%-ный формамид в буфере [c.159]

Все разновидности методов гибридизации, рассмотренные в этой главе, базируются на вышеупомянутых специфических взаимодействиях пар оснований комплементарных цепей нуклеиновых кислот. Точное соответствие последовательностей гибриди-зующихся фрагментов приводит к быстрому образованию прочного комплекса, устойчивого к высокой температуре в ходе гибридизации и отмывки. Такие комплексы устойчивы также и при низкой концентрации соли. Комплексы, образующиеся при относительно более слабом соответствии структуры цепей, в жестких условиях (высокая температура или низкая концентрация соли) менее устойчивы. При этом гибридизация либо не происходит вовсе, либо гибридный комплекс разрушается при отмывке. Генные семейства, у которых наблюдается некоторая степень гомологии, можно выявить варьированием условий гибридизации и отмывки. Этот же подход применяется и при сравнении аналогичных генов разного видового происхождения. [c.43]

Ранее П. Доти (США) и его сотрудники показали, что двойную спираль ДНК можно расплетать или денатурировать, применяя различные воздействия (повышение температуры, изменение pH и др.). В то же время, если инкубировать денатурированную одноцепочечную ДНК при температуре ниже той, которая вызывает денатурацию, комплементарные цепи реагируют между собою, вновь образуя двойную спираль, — происходит ренатурация ДНК. Если к ДНК добавить комплементарную РНК, может происходитьобразование гибридов ДНК—РНК — гибридизация, которая в дальнейшем стала одним из мощнейших методов изучения нуклеиновых кислот, позволяя выявлять комплементарные молекулы. [c.20]

Моногибридный гетерозис является очень удобной и широко используемой элементарной моделью для изучения биохимических основ гетерозиса при простейших аллельных взаимодействиях генов. На молекулярном уровне гетерозис проявляется в усилении синтеза нуклеиновых кислот н белков. Митохондрии простых меж-лииейных гибридов кукурузы превосходят митохондрии исходных самоопыленных линий по нитеиснвиости окислительного фосфорн-лирования и содержанию АТФ (митохондриальный гетерозис). Ряд ученых па основании электрофоретического изучения компо- [c.301]

С помощью ДГГЭ, также как и при РНКазном расщеплении, можно исследовать фрагменты нуклеиновых кислот (РНК, ДНК, гибриды РНК—ДНК) длиной от 100 до 1000 п.н. Верхний предел значений длин в некоторой степени определяется необходимостью использовать полиакриламидный гель. Подвижность в нем фрагментов ДНК длиной более 1000 п. н. резко снижается. [c.134]

Наказато использовал этот прием для обнаружения немеченного гибрида РНК—ДНК. Против такого гибрида удается получить антисыворотку кролика. Как обычно для нуклеиновых кислот [Ples ia, 1968], иммунизацию осуществляли его комплексом с метилированным альбумином. Интересно, что полученная анти- [c.285]

В рассматриваемом случае центрифугирование проводили в роторе MSE 10X10 Т1 при частоте вращения 45 тыс. об/мин и 25° в течение 68 ч. Вносили по 4,6 мл исходного раствора соли, содержащего 5—10 мкг меченной по Н смеси нуклеиновых кислот. Начальные плотности солевых растворов ро были выбраны так, чтобы в каждом случае разделить максимальное число различных классов нуклеиновых кислот. Например, для градиента sjSOi оно равно четырем от нативной ДНК до РНК. При центрифугировании в градиентах s l и Nal РНК оказывается в осадке на дне пробирки. Любопытно различие в относительном расположении пика гибрида ДНК —РНК для градиентов растворов солей цезия и Nal. Можно предполо- [c.248]

В заключение этой главы кратко рассмотрим уже упомянутый метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, осуществляемой на кольцевых ковалентно замкнутых молекулах ДНК по типу катящегося кольца (rolling ir le amplifi ation -R A) [331]. В методе линейной R A используется один праймер, комплементарный кольцевой одноцепочечной ДНК, которая может быть получена денатурацией исходных двухцепочечных молекул. Синтезировав комплементарную цепь, ДНК полимераза начинает вытеснять 5 -конец синтезированной цепи из гибрида, причем процесс продолжается непрерывно на протяжении всей реакции, во время которой фермент совершает множество оборотов вокруг амплифицируемой кольцевой матрицы. Продуктом R A является длинная одноцепочечная ДНК, в которой мономеры, комплементарные исходной кольцевой молекуле, следуют друг за другом в виде конкатемера. Поскольку в этом случае гигантская молекула ассоциирована с единственным праймером, метод R A с успехом используется для амплификации сигнала на микроматрицах [331]. При этом на двумерных и трехмерных микроматрицах имеет место возрастание сигнала в 10 ООО раз по сравнению с сигналом, получаемым от отдельного зонда, меченного флуоресцентным красителем. Ковалентное связывание 5 -концов праймеров для R A с антителами позволяет обнаруживать белки в концентрации до 0,1 пг/мл анализируемой жидкости [332, 333]. [c.250]

Основной недостаток методов фенотипического выявления гибридных клонов плазмид и вирусов заключается в том, что с их помощью не удается отобрать гибриды, содержащие специфические последовательности ДНК. Последние можно легко выявить методами гибридизации нуклеиновых кислот in situ в колониях трансформированных клеток или в бляшках вирусов. Эти процедуры начиная с 1975 г. интенсивно совершенствовались, и в настоящее время они достаточно просты и активно используются в работах по клонированию генов. [c.34]

Выбравр = 0,99 и зная средний размер вставок, можно рассчитать необходимый объем библиотек для разных геномов (табл. 2.1). Библиотеки такого объема называют представительными. Их можно использовать для процедуры, получившей название прогулка по хромосоме . Суть этого подхода состоит в том, что при помощи гибридизации нуклеиновых кислот выявляют клоны гибридов, вставки у кото- [c.103]

Рис. 4-59. Схема получения гибридных клеток, или гибридом , синтезирующих гомогенные моноклональные антитела против определенного антигена (X). Использованная для роста клеток селективная среда содержит ингибитор (амин о пт ер ин), блокирз ющий нормальные пути биосинтеза нуклеотидов. Поэтому для синтеза нуклеиновых кислот клеткам приходится использовать обходной путь (шунт) биосинтеза. Но именно этот шунт нарушен у мутантных клеток, использованных для слияния с нормальными В-лимфоцитами. Поскольку ни одна из взятых для опыта клеточных

Вначале предполагали, что ДНК и РНК в клетке разобщены, причем ДНК находится исключительно в ядре, а РНК всегда вне его, т. е. в цитоплазме (что уже свидетельствует о неточности первоначального понятия нуклеиновые , т. е. ядерные , кислоты). Сейчас ясно, что хотя основная масса ДНК действительно сосредоточена в клеточном ядре, точнее в его хромосомах (см. гл. 2), но наряду с этим некоторое количество ДНК содержится также в других клеточных компонентах, в частности в хлоропластах зеленых растений (см. гл. 3). Что же касается РНК, то она встречается не только в цитоплазме, но и в так называемых ядрышках (nu leolus, уменьшительная форма от латинского nu leus — ядро), имеющихся во всех клеточных ядрах (в количестве одного или нескольких экземпляров). Наконец, теперь известно, что существуют молекулы смешанного типа, нечто вроде гибридов , в которых цепь ДНК, пусть даже временно, лишь на короткий срок, соединена с цепью РНК. Прежде чем приступить к более детальному выяснению того, зачем и для чего нужны все эти разъединения и соединения, нам нужно ознакомиться с третьим компонентом нуклеотидов — с органическими основаниями. [c.46]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология