Денатурация двухцепочечных

Рис. 4-66. Семейство меченных но 5 -концу фрагментов ДНК. полученных в результате рестрикции по определенному нуклеотиду (в данном случае основание А) Анализируемая цепь ДНК - продукт денатурации двухцепочечной молекулы, вьщеленной с помощью метода, описанного на рис. 4-65, Б. Эт> цепь подвергли мягкой химической обработке, удаляющей из цепи некоторое количество одного из четырех нуклеотидов при этом большинство таких нуклеотидов остаются в цепи. Поскольку только фрагменты, указанные на рисунке слева, содержат 5 -конец и Р-фосфатную группу на ней, именно эти фрагменты регистрируются после радиоавтографии геля. Данная процедура лежит в основе химического метода

Инкубируйте смесь 5 мин при 95 °С для денатурации двухцепочечной ДНК- [c.143]

Поскольку взаимодействия между основаниями двух цепей ко-оперативны, подобно взаимодействиям между молекулами в кристалле, упорядоченная спиральная структура разрушается в пределах небольшого температурного интервала, как это происходит при плавлении кристалла. По этой причине денатурацию двухцепочечной ДНК при нагревании часто называют плавлением ДНК, а температуру, при которой денатурировано 50% ДНК,— температурой плавления Тил. [c.224]

С) высокой вязкостью. Если такой раствор нагреть до температуры выше 80-90°С или довести его pH до экстремальных значений, то вязкость раствора резко упадет, что указывает на изменение физического состояния ДНК. Мы уже видели, что высокая температура и экстремальные значения pH приводят к денатурации, или раскручиванию глобулярных белков (разд. 6.12). Точно так же высокие температуры и экстремальные значения pH вызывают денатурацию, или расплетание, двухцепочечных спиралей ДНК, разрушая водородные связи между спаренными основаниями и гидрофобные взаимодействия, с помощью которых удерживались вместе уложенные в стопку основания. В результате двойная спираль расплетается с образованием хаотических, беспорядочных одноцепочечных клубков до тех пор, пока обе цепи, наконец, не разделятся полностью. При денатурации (ее называют также плавлением) ковалентные связи в остове молекулы не разрываются (рис. 27-14). [c.865]

Гипохромизм важен не только сам по себе, как чрезвычайно интересное оптическое явление, но главным образом как феномен, дающий нам в руки простой и удобный метод, который можно использовать в химии нуклеиновых кислот для качественной и количественной оценки процессов ориентации — дезориентации (таких, как денатурация, ренатурация, обратимое образование гомополимерных комплексов или образование гибридных спиралей ДНК — РНК), а также для установления генетической связи между ДНК из различных организмов или из различных клеток одного и того же организма. Все, что требуется для проведения такой оценки,— это спектрофотометр или какой-нибудь другой прибор, с помощью которого можно измерять поглощение света в области 260 ммк. Первый максимум поглощения у всех исследованных видов ДНК располагается в интервале 256—265 ммк вблизи 230 ммк находится минимум, а второй максимум поглощения лежит в далекой ультрафиолетовой области, при 195 ммк. Для обычных двухцепочечных ДНК коэффициент поглощения в расчете на 1 моль фосфора колеблется в пределах 6100—6900, что составляет 18,0—19,0 на 1 мг ДНК (для РНК соответствующая величина близка к 23). [c.144]

Необратимая денатурация. В последние годы много внимания было уделено изучению процессов разделения и рекомбинации комплементарных цепей в двухцепочечных полинуклеотидах. Оказалось, что при соответствующих условиях две комплементарные цепи можно полностью разделить. Этот процесс протекает достаточно медленно (в течение нескольких минут) и требует относительно жестких условий он идет хорошо в тех случаях, когда температура или величина отклонения pH от нейтрального значения превышают значения, соответствующие точкам обратимого перехода (см. фиг. 55). Процесс, обратный денатурации рекомбинация двух цепей), может быть осуществлен только при соблюдении некоторых, перечисленных ниже условий. [c.152]

Сильная зависимость хода реакции с карбодиимидом СП от вторичной структуры и ограничение действия нуклеаз после модификации позволяют использовать реакцию с этим карбодиимидом для обнаружения полинуклеотидных участков, на которых происходит разрущение двухцепочечного комплекса при частичной денатурации ДНК 2. После обработки ДНК карбодиимидом СП, а затем панкреатической ДНК-азой и фосфодиэстеразой змеиного яда удается выделить длинные олигонуклеотиды, возникающие из дефектных участков полимера. [c.385]

Денатурация. Денатурацией называют процесс разрушения двухцепочечной вторичной структуры ДНК. В прошлом было не вполне ясно, обязательно ли при этом происходит разделение цепей. Можно легко представить себе разрушение двухцепочечной структуры ДНК и без разделения цепей. После того как денатурация произошла, целый ряд факторов мешает спонтанному восстановлению структуры, т. е. спариванию комплементарных оснований и образованию спирали, характеризующейся теми же параметрами, что и исходная. Денатурирующие агенты часто вызывают и более глубокие изменения, например нагревание приводит к уменьшению числа пуриновых оснований в полинуклеотидных цепочках. [c.319]

ДНК, подвергнутая тепловой денатурации, часто оказывается более эффективной, чем нативная ДНК. Прекрасной затравкой является одноцепочечная ДНК бактериофага фХ 74. В обоих случаях синтезируется двухцепочечная ДНК. [c.331]

При использовании других бактериальных РНК-полимеразных систем оказалось, что продукт состоит частично из ДНК— РНК-комплексов, которые диссоциируют при нагревании до 100 В растительных экстрактах (изолированный хроматин из зародышей гороха) РНК остается связанной в ДНК — РНК-белковые комплексы и освобождается в форме, доступной действию рибонуклеазы, только после предварительной обработки дезоксирибонуклеазой или после нагревания до 60" в течение короткого времени оказалось, что в этом комплексе отношение РНК к ДНК равно 1 2. Так как температура диссоциации комплекса ниже температуры денатурации ДНК, пришли к заключению, что освобождение РНК (и ДНК) из комплекса происходит вследствие денатурации белка. Однако вероятно также, что трехцепочечный полинуклеотидный комплекс должен быть менее устойчивым, чем двухцепочечный комплекс. [c.320]

Линейная одноцепочечная ДНК редкий в природе тип молекулярной организации ДНК. Например, ДНК мелкого вируса мыши. Но такой тип ДНК легко получить при денатурации линейных двухцепочечных ДНК- Разрыв водородных связей между комплементарными полинуклеотидными цепями заканчивается раскручиванием двойной спирали и последующим разделением двух полинуклеотидных цепей. Образовавшиеся две более гибкие по сравнению с исходной молекулы быстро свертываются в беспорядочные клубки. Будучи гораздо более гибкими, линейные одноцепочечные ДНК в растворе характеризуются значительно меньшей вязкостью. Соответственно изменяются и другие гидродинамические характеристики одноцепочечной ДНК по сравнению с линейной двухцепочечной. Медленное охлаждение раствора ДНК после температурной денатурации ведет к образованию ренатурированной ДНК с типичным линейным двухцепочечным строением. [c.58]

Характер зависимости ультрафиолетового поглощения от температуры для многоцепочечного спирального комплекса, образованного ферментативно синтезированными полирибонуклеотидами, находится в полном соответствии с двуспиральной структурой ДНК [238]. Был изучен ряд всевозможных комбинаций, и все они обладали относительно узкими областями структурных переходов, характерными для кооперативного процесса тепловой денатурации. Двухцепочечный комплекс из полиадениловой и полиуридиловой кислот в тех условиях (0,15 М раствор хлористого натрия), которые использовали для тепловой денатурации дезоксирибонуклеиновых кислот, имел т. пл. 61 . И в этом случае ионная сила очень сильно влияла на температуру тепловой денатурации в 1 М растворе хлористого натрия температура плавления для поли-аденилил-полиуридилового комплекса повышалась приблизительно до 82 [c.578]

Формамид является лучшим растворителем для снижения температур денатурации двухцепочечных комплексов ДНК и гибридов РНК — ДНК. При более низких температурах денатурации снижается степень термической деградации нуклеиновых кислот. В буферах, содержаш,их от 0,035 до 0,88 М Na I, на каждый процент формамида Тт ДНК снижается на 0,60 °С [34]. Для гибридизации рРНК на фильтре Джиллеспи и Джиллеспи [29] применяли 50%-ный формамид в буфере [c.159]

Устойчивость к рибонуклеазе утрачивалась после нагревания препарата до 100 °С в растворе с низкой концентрацией соли и последующего быстрого охлаждения, т. е. после обработки, которая, как известно, приводит к денатурации двухцепочечной РНК. Соответствующий материал из растений, инфицированных ВЖМТ, обнаруживал зависимость между температурой ж поглощением в ультрафиолетовой области, типичную для двухцепочечных нуклеиновых кислот [215]. [c.148]

Как и в случае ДНК, двухцепочечные участки в РНК разрушаются при повьппении температуры или pH, но, в отличие от ДНК, при высоких значениях pH в РНК разрушаются и фосфодиэфирные связи. Поскольку протяженность спирал и зова иных участков в одноцепочечной РНК невелика, а сами спирали несовершенны, разрушаются они довольно легко. Однако полностью комплементарная двухцепочечная РНК плавится в довольно узком температурном интервале, как и двухцепочечная ДНК. В результате денатурации образуются две комплементарные одиночные цепи, способные к после-дуюшему воссоединению при плавном понижении температуры. После денатурации двухцепочечных участков одноцепочечной РНК восстановление тех же спаренных областей оказывается затрудненным, и в результате ренатурации могут образоваться структуры, отличные от исходной. [c.54]

В то время как основные типы РНК, обнаруживаемые в природе, являются однонитевыми нуклеиновыми кислотами, небольшая часть вирусов, например реовирусы, содержат РНК в виде двойной спирали. Эти РНК имеют такой состав оснований, в котором А = и и О = С. Они проявляют заметную устойчивость к гидролизу рибонуклеазами, если их не подвергать предварительной тепловой денатурации. Такие РНК могут быть выделены из растворов в виде нитей или же аналогичные нити могут быть приготовлены из препаратов синтетических двухцепочечных полимеров типа [(гА)-(ги)] и использованы для исследования методом диффракции рентгеновских лучей [63]. Данные рентгеноструктурного анализа свидетельствуют о том, что двухцепочечные РНК принимают спиральную форму, имеющую очень близкое сходство с /4-формой ДНК (наклон плоскости пар оснований к основной оси спирали около 10°, и на один виток спирали приходится 11 —12 оснований). Создается впечатление, что конформация такой /4-формы РНК, подобно /4-форме ДНК, диктуется формой углеводного кольца, находящегося в С-3-з/ (Зо-конформации. Вполне очевидно, что урацил может взаимодействовать с аденином столь же эффективно, как и тимин в образовании водородных связей. [c.60]

Рис. 4.12. Получение меченого ДНК-зонда методом случайных праймеров. К денатурированной двухцепочечной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций из шести нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гибридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех с1НТР (один из которых меченый [ ]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи. После денатурации синтезированной ДНК получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые вместе составляют практически полноразмерную исходную ДНК-матрицу.

Во втором раунде двухцепочечную ДНК, состоящую из исходной и новосинтезированной ( длинная матрица ) цепей, опять подвергают денатурации, а затем отжигают с праймерами. Во время синтеза в этом раунде вновь синтезируются длинные матрицы , а также некоторое количество цепей с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймеру, на другом ( короткие матрицы ) (рис. 5.19). Во время третьего раунда все гетеродуплексы, образовавщиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплицируются (рис. 5.20). В последующих раундах коротких матриц становится все больше, и к 30-му раунду их число уже в Ю раз превышает число исходных цепей или длинных матриц (рис. 5.21). [c.96]

На следующем этапе в реакционную смесь добавляют еще два олигонуклеотида, Е и Р. 3 -конец олигонуклеотида Е идентичен 5 "-концу олигонуклеотида С, а сам он отвечает участку реконструируемого гена, примыкающему слева к сегменту С. Аналогичными свойствами обладает олигонуклеотид Р, если его соотносить с олигонуклеотидом О. После денатурации и ре-натурации смеси образовавшиеся дуплексы с выступающими одноцепочечными участками достраиваются с 3"-гидроксильных концов. В ходе последующих раундов ПЦР образуется двухцепочечный продукт ЕСАВОР. [c.102]

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухцепочечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Праймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смещивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. соН разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. oli не сохраняются.

Ренатурация (Renaturation) Воссоединение цепей двухцепочечной ДНК, разошедшихся при денатурации. [c.558]

Так же как и двухцепочечные полинуклеотиды, одноцепочечные молекулы могут денатурировать с разрушением вторичной и третичной структур. Денатурация наблюдается при повышении температуры, понижении ионной силы или добавлении в среду дена-турирующих агентов — мочевины, органических растворителей и т. д. [c.344]

Денатурация ДНК сопровождается изменением конфигурации молекулы. Эти изменения связаны с разрывом водородных связей в двухцепочечной молекуле ДНК и расхождением полидезоксирибонуклеотидных цепей. [c.104]

Если оставшийся нерасплетенным двухцепочечный фрагмент ДНК, состоящий из десятка или большего числа комплементарных нуклеотидов, все еще продолжает удерживать цепи от полного расхождения, то процесс денатурации может быть легко обращен. Это значит, что при приведении температуры и величины pH вновь к физиологическим значениям расплетенные участки двух цепей самопроизвольно сплетутся, образуя исходный дуплекс (отжиг, рис. 27-14). Однако если расхождение цепей полностью завершено, то ренатурация будет происходить в два этапа. Первый из них протекает сравнительно медленно, поскольку две цепи должны отыскать друг друга в ходе случайных столкновений и образовать короткие комплементарные участки двойной спирали. Второй этап осуществляется гораздо быстрее, так как остальные основания последовательно состыковываются и образуют пары комплементарных оснований. Затем две цепи застегиваются наподобие молнии, вновь образуя двойную спираль. [c.865]

Если нативную ДНК обработать экзонуклеазой III, образуется частично одноцепочечная молекула (стр. 95). С помощью полимеразы она может быть реставрирована в нативную двухцепочечную мо.лекулу. Вновь синтезированная ДНК ковалентно связана с З -гидроксильным концом деградированной цепи матрицы. Полностью реставрированная ДНК близка к исходной нативной ДНК по форме молекулы (на электронных микрофотографиях), по результатам анализа в градиенте плотности, по способности к денатурации и по генетической активности [148]. Во время синтеза ДНК, идущего вслед за фазой реставрации молекулы, образуется структура, не связанная ковалентно с матрицей она напоминает продукт, полученный на нативной ДНК в качестве матрицы, по своей разветвленной форме, неденатурабильности и отсутствию генетической активности. [c.201]

Рибосомную и вирусную РНК лучше рассматривать вместе, поскольку мы имеем здесь дело с молекулами, близкими как по своим размерам, так и по свойствам. Эти полирибонуклеотиды состоят, по-видимому, из одинаковых одноцепочечных и чрезвычайно гибких молекул, легко претерпевающих деформацию. В гидродинамическом отношении такие молекулы ведут себя как беспорядочно свернуты е клубки (особенно при низкой ионной силе и высокой температуре). Из этого вытекают следствия, о которых мы ун е говорили выше во-первых, сильная зависимость различных оптических и гидродинамических свойств этих полирибонуклеотидов от ионной силы и от некоторых других факторов и, во-вторых, близкое сходство ряда теоретических и экспериментальных параметров с соответствующими параметрами для других полиэлектролитов. Отдельные структурные компоненты в молекуле РНК связаны между собой так же, как они связаны в ДНК иными словами, молекула этого полирибопуклеотида представляет собой одиночную неразветвленную цепь, построенную из мономерных единиц, которые связаны между собой 3, 5 -фосфодиэфирным11 связями. Поскольку ОН-группа в положении 2 не замещена, полирибонуклеотиды расщепляются под действием не слишком концентрированной щелочи (что отличает их от полидезоксирибонуклеотидов) другие характерные для них реакции рассмотрены выше. Способность свободных аминогрупп вступать в реакции с такими соединениями, как НКОа и НСНО, у РНК выше, чем у ДНК (но ниже, чем у свободных нуклеотидов) однако не все остатки, по-видимому, одинаково реакционноспособны. Гипохромизм у РНК выражен слабее, а интервал денатурационного перехода у них значительно шире, чем у двухцепочечных ДНК. Кривые денатурации напоминают по форме кривые, получаемые при плавлении одпоцепочечных ДНК. Положение точки перехода у РНК, так же [c.155]

Образующиеся в результате реакщ1И двухцепочечные комплексы могут быть разделены препаративным центрифугированием в градиенте хлористого цезия после денатурации действием щелочи Полученные продукты имеют мол. вес. от 10 до 4 10 . [c.102]

При алкилировании ДНК под действием иприта бис-(гуанил)-этильные производные образуются за счет остатков гуанина, содер-л<ащихся в различных цепях двухцепочечного комплекса Вследствие этого уже при очень малой степени алкилирования ДНК теряет способность к денатурации с полным расхождением цепей. Аналогичная картина наблюдается и в начальной стадии реакции ДНК с бис-( -хлорэтил)-метиламином При более высокой степени алкилирования производные типа X VH, по-видимому, образуются в заметно больших количествах за счет алкилирования соседних остатков гуанина в одной и той же полинуклеотидной цепи [c.380]

Скорость реакции формальдегида с полинуклеотидами в большой степени зависит от вторичной структуры полимера реакция очень сильно замедляется или практически не протекает с двухцепочечными комплексами полинуклеотидов, стабилизованными водородными связями Ч Поэтому обработка формальдегидом широко используется в исследованиях вторичной структуры полинуклеотидов (см. гл. 4). Эта реакция была применена для изучения вторичной структуры полиадениловой и полицитидиловой кислот, а также для определения размеров и стабильности двухспиральных участков (см. также Денатурированная ДНК быстро реагирует с формальдегидом, причем продукт реакции теряет способность к ренатурации 4. Нативная ДНК, напротив, реагирует с формальдегидом крайне медленно анализ кинетики реакции показывает, что реакция начинается на дефектном участке двухспиральной структуры и концентрацию таких участков можно определить . Частичную денатурацию ДНК по специфическим участкам при действии формальдегида можно наблюдать под электронным микроскопом Модификация полинуклеотидов формальдегидом была применена и для некоторых функциональных исследований, в частности для изучения инактивации тРНК и для исследования изменения кодирующей способности полиадениловой кислоты в бесклеточной системе [c.412]

Репликативная форма РНК — один из типов макромолекулярной организации РНК с полностью двухспиральным строением. Репликативные формы РНК обнаружены в вирусах полиомиелита, сендай и энцефаломиокардита. Анализ комплементар-вости пар азотистых оснований в таких РНК, устойчивость к действию панкреатической РНК-азы, характер тепловой денатурации, отсутствие реакции с формальдегидом и рентгеновская дифракция — все подтверждает двухспиральное их строение. Репликация вирусных РНК проходит через стадию образования двухцепочечной репликативной формы. [c.73]

Циклические перестановки — структурные огобенности поведения некоторых фаговых ДНК, подвергнутых температурной денатурации и последующему медленному отжигу. Напрнмер, денатурированная линейная двухцепочечная ДНК бактериофага Т2 при медленном отжиге образует кольцевые молекулы, что происходит вследствие того, что популяция молекул фаговой ДНК состоит из набора молекул с циклическими перестановками. Схематически такие структурные перестройки показаны на рис. 34. [c.87]

Экзонуклеаза I —фермент, гидролизующий одноцепочечную ДНК, которая образуется при тепловой денатурации- К нативной двухцепочечной ДНК. экзонуклеаза I практически не чувствительна. Впервые фермент был обнаружен в клетках кишечной палочки. Экзонуклеаза I гидролизует цепи ДНК, начиная с З -гидроксильного конца, продуктами реакции являются дезоксирибонуклеозид-5 -монофосфаты, Реакция продолжается до тех пор, пока от ДНК не останется единственный динуклеотид, который не может служить субстратом для экзонуклеазы I. Этот фермент лишен способности также расщеплять 5 -концевые динуклеотиды, входящие в состав полидезоксирибонуклеотидной цепи. Не чувствителен он и к полнрибонуклеотидам. [c.88]

При полной тепловой денатурации очищенных высокомолекулярных препаратов ДНК оптическая плотность должна повышаться на 40%. Эта величина зависит от содержания ГЦ-пар с увеличением их доли она слегка уменьшается (см. фиг. 2). Гиперхромизм может также служить крите рием качества препарата для плохих частично денатурированных или загрязненных препаратов характерен гиперхромизм ниже 40%, тогда как для агрегированных препаратов прирост поглощения может превысить. 40%. При быстром охлаждении денатурированной ДНК образуются не большие частично ренатурироваиные двухцепочечные участки, что понижает величину гиперхромизма при 25° такой препарат дает поглощение приблизительно на 12 /о выше, чем нативная ДНК. [c.190]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология