Антитела к к гибридным белкам

ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЕТЕРОЛОГИЧНЫМ ФРАГМЕНТАМ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ -ГАЛАКТОЗИДАЗУ [c.138]

Поликлональные антитела к фрагментам гибридных белков [c.141]

Независимо от того, как был получен клон ДНК, сначала его секвенируют (определяют нуклеотидную последовательность), определив таким образом положение всех открытых рамок считывания и удобных сайтов рестрикции. Установив нуклеотидную последовательность ДНК, можно предсказать молекулярную массу гибридного белка и оценить степень деградации выделенного продукта. Далее, при необходимости можно повторить генноинженерные эксперименты или перейти к выделению гибридных белков и получению специфических антител. [c.142]

Чтобы снизить вероятность получения ошибочных результатов, мы советуем исследовать лизат, содержащий гибридные белки, с помощью вестерн-блот-анализа с использованием антител к -галактозидазе (рис. 5.3) —это позволяет детектировать все минорные продукты. Кроме того, все получаемые результаты необходимо сопоставить с анализом нуклеотидной последовательности клонированный ДНК. Для идентификации продуктов клонированных генов можно также использовать вторые антитела, специфичные к антигенным детерминантам, которыми предположительно должен обладать гибридный белок. Поскольку уровень экспрессии гибридных белков высок, мы рекомендуем использовать иммуноферментный метод выявления антигенов с помощью вестерн-блот-анализа (табл. 5.2) ввиду надежности и быстроты этого метода. [c.149]

Экстракты, выделенные, как описано в разд. 5.3.2 (п. 2, 3 или 4), могут быть непосредственно нанесены на аффинные колонки, содержащие антитела к -галактозидазе без какого-либо предварительного фракционирования (например, удаления нуклеиновых кислот). Поэтому гибридные белки, характеризующиеся низкой стабильностью или низким содержанием в клетке, могут быть легко выделены из разбавленных экстрактов без деградации, возможной при более длительных методах выделения. [c.157]

Во многих случаях необходимо или желательно получить очищенные с помощью аффинных методов антитела, специфические по отношению к определенному антигену. Ниже приводятся детальные методы фракционирования антисыворотки к гибридным белкам, позволяющие получать антитела, специфичные по отношению к гетерологичному фрагменту белка. Общая схема выделения специфических антител приведена на рис. 5.8. [c.165]

З. Выделение антител, специфичных по отношению к гетерологичному фрагменту гибридного белка [c.166]

Метод, описанный в этом разделе, — самый надежный метод выделения антител к гетерологичному фрагменту гибридного белка. По нашим данным, он пригоден даже в случае наиболее трудных в этом отношении гибридных белков. При использовании этого метода можно получить 1—2 мг антител к гетерологичному фрагменту гибридного белка за один цикл работы. Метод позволяет преодолеть проблемы растворимости и низкого выхода путем связывания гибридного белка непосредственно из грубого экстракта смолой, содержащей специ- [c.166]

На колонку, содержащую 5 мг -галактозидазы или 5 мл смолы, сшитой с гибридным белком (табл. 5.6), нанесите 10—20 мл антисыворотки. Проводите элюцию PBS и промывайте колонку буфером BBS-твин ) до тех пор, пока с нее не перестанет сходить белок. Уравновесьте колонку PBS. Для обеспечения наиболее полной элюции элюируйте связавшиеся антитела 4 М гуанидинхлоридом. Диализуйте собранный пик против 100 объемов PBS ) как минимум три раза, диализуя раствор против каждой смены буфера не менее трех часов. Снова уравновесьте колонку 3—5 объемами PBS. [c.167]

Промойте колонку элюирующим буфером и снова уравновесьте ее PBS, как описано в табл. 5.7. Нанесите на колонку несвязавшуюся фракцию антисыворотки с колонки, содержащей иммобилизованную -галактозидазу, промойте ее и элюируйте фракцию, содержащую антитела к гибридному белку, как [c.167]

Перед проведением аффинного выделения антител к гибридному белку предварительно промойте колонку, как описано в табл. 5.7. [c.168]

Регистрируя оптическую плотность белкового материала с помощью соединенного с колонкой высокочувствительного спектрофотометра, нанесите еще раз фракцию диализованных антител, полученных на стадии 4, на аффинную колонку с иммобилизованной -галактозидазой, уравновешенную PBS для удаления возможных примесей антител к -галактозидазе. Теперь фракция, сходящая с колонки, должна содержать только антитела к чужеродному фрагменту гибридного белка. [c.168]

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГИБРИДНЫМ БЕЛКАМ, ПРОДУЦИРУЕМЫМ В КЛЕТКАХ Е. сои [c.171]

Рис. 6.1. Схема, демонстрирующая этапы получения моноклональных антител к гибридным белкам, продуцируемым в клетках Е. соН, и области их возможного применения.

Получение моноклональных антител к гибридным белкам [c.180]

СЯ, поскольку будут отбираться моноклональные антитела только к эпитопам, свойственным продуктам клонированной вставки. Выделение растворимых гибридных белков детально рассматривается в предыдущей главе. [c.181]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Два Примера белков, состоящих из нескольких субъединиц образование которых удалось осуществить в клетках . соИ, — это инсулин [11] и IgG (антитела к раково-эмбриональному антигену, EA [34]). В обоих случаях гены, кодирующие разные субъединицы, клонировали и экспрессировали независимо друг от друга. А- и В-цепи инсулина синтезировали в виде гибридных белков и были выделены, очищены и S-сульфонированы, как описано в табл. 4.7 и 4.15. S-сульфонированные производные очищали ионообменной хроматографией и обратнофазовой ЖХВД перед восстановлением исходной конформации белков. [c.127]

Рпс. 5,3. Два примера аномального поведения гибридных белков. Фрагмент кДНК Antennapedia был встроен в вектор Xgtll в двух разных рамках считывания. Самый большой по размеру из мажорных продуктов (дорожка 1) синтезируется при считывании с неправильной рамкой, но вследствие чрезвычайно высокого содержания G в ДНК и пролина в белке образующийся продукт обладает такой же подвижностью, как продукт, кодируемый правильной рамкой считывания черная стрелка, дорожка 1). Вторая рамка считывания (дорожка 2) правильная, и размер ее мажорного продукта (дорожка 2, черная стрелка) также соответствует заранее рассчитанному. Однако этот белок не является полноразмерным гибридным белком. Минорный продукт большего размера (дорожка 2, светлая стрелка) выявляется при окрашивании с использованием антител к -галактозидазе (данные не представлены) и антител к С-концевому участку белка (данные не приведены). Высокое содержание пролина в гибридном белке приводит к увеличению кажущейся молекулярной массы на 10—15 кДа. Этим объясняется ошибочный вывод о том, что обладающий низкой подвижностью продукт деградации является полноразмерным белком. [c.146]

Размер гетерологичного белкового фрагмента — важный параметр при клонировании гибридных белков, содержащих -галактозидазу. Стабильность (а следовательно, и выход) гибридных белков, как правило, снижается при увеличении размера чужеродного фрагмента. Во многих случаях желательно, чтобы в состав гибридных белков входили короткие фрагменты. Для получения специфических антител вполне достаточными оказываются фрагменты гетерологичной ДНК, кодирующей антиген длиной всего 200 п.н. [16]. Вместе с тем использование коротких фрагментов может привести к тому, что при небольшой относительной массе чужеродного полипептида (по сравнению с массой -галактозидазы) титр специфичных к чужеродному белку антител у иммунизированных животных окажется низким. Аффинная очистка антител в этом случае также менее эффективна вследствие низкой емкости аффинных колонок, в которых связанные с носителем гибридные белки несут короткие гетерологичные фрагменты. Один из путей решения этой проблемы состоит в увеличении молярного соотношения гетерологичный фрагмент -галактозидаза в гибридном белке. Это достигается пришиванием к гену la Z множественных тандемных копий гетерологичного фрагмента ДНК. На рис. 5.5 приведены сравнительные результаты клонирования и экспрессии одной из пяти копий кодирующего фрагмента гена ftz Drosophila в pUR291. Выход гибридного белка, кодируемого одной копией этого гена, примерно в десять раз превышает выход белка, кодируемого пятью тандемными копиями. [c.147]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Клоны с иммобилизованными антителами к -галактозидазе можно приготовить, как это описано в разд. 5.4, или использовать коммерческие препараты. Возможность повторного использования колонки зависит от свойств антител (моноклональных или поликлональных) и жесткости элюирующих растворов. Колонки с поликлональными антителами (полученные, как здесь описано) могут быть использованы более 20 раз без значительного уменьшения их связывающей способности. Колонка, содержащая 5 мг аффинноочищенных поликлональных антител к -галактозидазе, обычно связывает по меньшей мере 1 мг гибридного белка. [c.157]

При использовании антигенов, полученных с помощью хроматографических методов и поэтому, по крайней мере частично, растворимых, смешайте 0,2—2,0 мг интактного гибридного белка, растворенного в 1 мл физиологического раствора или PBS с 1,25 мл полного адъюванта Фрейнда и получите гомогенную эмульсию, как описано выше. Сделайте зафиксированному кролику подкожные инъекции в несколько мест. Повторите инъекции 0,2—1,0 мг антигена в неполном адъюванте Фрейнда на 14-й и 21-й день и с 28-го дня начинайте брать кровь. Для определения титра антител берите кровь еженедельно и повторите введение 0,2—1,0 мг антигена, когда титр антител начнет уменьшаться. После получения достаточного количества антисыворотки, пока титр антител остается достаточно высоким, возьмите под анестезией кровь из сердца кролика. [c.163]

Для определения количества специфичных к гибридному белку антител, присутствующих в сыворотке, и для получения препарата антител, не загрязненного антителами к -галактозидазе, антисыворотку к гибридному белку сначала наносят на аффинную колонку, содержащую иммобилизованную -галактозидазу. Для подготовки такой колонки используют 5—7 мг очищенной -галактозидазы Е. oli (Sigma) диализованной против PBS. Метод подробно приводится в табл. 5.6. [c.165]

Антитела выделяют, как описано в табл. 5.7. Поскольку фракция антител, специфичных к геторологичному фрагменту гибридного белка не связывается с колонкой, ее собирают без значительных потерь, промывая колонку PBS. Элюируемая фракция антител, специфичных к -галактозидазе, служит хорошим контролем в опытах, где используются антитела к гибридным белкам, и может применяться для приготовления аффинных колонок для выделения гибридных белков (см. ниже). [c.165]

Уравновесьте колонку PBS > при 4°С. Нанесите на нее при 4°С обогащенный экстракт индуцированной лизогенной культуры или клона, несущего плазмид) pUR, содержащий не менее 3—5 мг интактного гибридного белка. Промойте колонку одним объемом PBS при 4 °С, затем, уже при комнатной температуре, промойте ее тремя объемами ВВ5-таин >, двумя объемами 0,1 М бората натрия (pH 8,2) и двумя объемами 0,2 М триэта-ноламина (pH 8,2) для удаления несвязавигегося белка и подготовки для сшивания связавшегося гибридного белка с иммобилизованными антителами к -галактозидазе. [c.168]

Для определения специфичности антител к чужеродному фрагменту гибридного белка на каждой стадии их очистки важно отличать антитела к -галактозидазному компоненту гибридного белка от антител к гетерологичному его фрагменту. Самый простой способ для этого — определение активности анти- [c.168]

Препарат антител, очищенных стандартным способом, как описано в этом разделе, не будет связываться с -галактозидазой или антигенами Е. oli, а будет взаимодействовать со всеми формами гибридного белка, содержащими антигенные детерминанты гетерологичного фрагмента (рис. 5.4, крайняя правая дорожка). [c.169]

Трудности, с которыми можно столкнуться при наработке моноклональных антител, связаны с получением достаточного количества иммуногена и последующим скринингом сыворотки для выявления нужной иммунологической активности. Использование гиперэкспрессии гибридных белков может облегчить преодоление этих трудностей, поскольку дает возможность выделять большие количества белкового продукта с помощью электрофореза или хроматографии. При скрининге сыворотки и полученных затем гибридных клонов можно применять метод радноиммунного анализа (РИА, RTA) или метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). [c.173]

Использование гибридных белков для получения моноклональных антител имеет особое преимущество участки молекулы нативного белка, обладающие сильной или слабой иммуноген-ностью, могут изменить свои иммуногенные свойства при экспрессии в составе большого гибридного белка. Это особенно важно при получении антител к иммунологически неактивным ( молчащим ) участкам молекулы белка. В случае большого Т-антигена вируса SV-40 получено много разных моноклональных антител, узнающих антигенные детерминанты на N- и С-концах нативного белка, но всего несколько видов антител, узнающих структуры, расположенные в центре молекулы. Мы успешно использовали этот подход для получения антител к такому иммунологически неактивному участку большого Т-антигена. [c.173]

Вестерн-блот-анализ гибридного белка Gal.T.HA, при котором в качестве зонда использовались моноклональные антитела к большому Т-антигену, показал, что гибридный белок подвергался деградации по всей длине. Например, антитело РАЬ423 (рис. 6.3), узнающее эпитоп, расположенный в С-концевом участке большого Т-антигена, связывается только с полосой на электрофореграмме, соответствующей белку с самой большой молекулярной массой, т. е. полноразмерным гибридным белком. Антитело РАЬ204, узнающее эпитоп, занимающий участок между аминокислотами 453 и 469 [5], взаимодействует с разными полосами, которые соответствуют как полноразмерным белковым продуктам, так и полипептидам с меньшей молекулярной массой, чем -галактозидаза. [c.178]

Клонирование фрагментов генома, содержащих ОРС, в экспрессирующих векторах позволяет нарабатывать для иммунизации большие количества чистого белка. Это делает получение моноклональных антител к белкам, кодируемым последовательностями ОРС, стратегически простой, хотя и в некоторой степени трудоемкой задачей. Основные требования при подобной работе— наличие хорошей культуры клеток и использование высокочувствительного метода анализа, позволяющего отличать антитела к продуктам ОРС от антител, узнающих векторные фрагменты гибридного белка. Отлаживание такого метода— основное узкое место рассматриваемого подхода. После получения специфических моноклональных антител к продукту, кодируемому встроенным фрагментом, их можно использовать для выявления, количественного анализа и очистки белкового продукта ОРС. [c.180]

Выделение гибридных белков, содержащих -галактозида-зу, было детально описано в предыдущей главе. Для иммунизации мышей требуются относительно небольшие количества антигена, поэтому его можно наработать любым методом. Хотя белковый материал, полученный в результате препаративного ДСН-электрофореза в ПААГ, не всегда обладает такими имму-ногенными свойствами, которые присущи большинству нативных препаратов, он имеет то преимущество, что вызываемый им иммунный ответ обусловлен устойчивыми к денатурации эпитопами. Используемый нами метод выделения нерастворимых гибридных белков приведен в табл. 6.4. Моноклональные антитела к таким эпитопам часто удается с успехом использовать в последующем детальном иммунохимическом анализе белковых антигенов. Наличие абсолютно чистого иммуногена не требует- [c.180]

На рис. 6.4 показана иммунопреципитация экстрактов инфицированных вирусом SV-40 клеток V-1 моноклональными антителами РАЬ204 (А) и мышиной антисывороткой к гибридному белку (рис. 6.4, Б). И те, и другие антитела дают специфическую иммунопреципитацию с большим Т-антигеном вируса SV-40. Это говорит о наличии иммунного ответа на инъекцию иммуногена — гибридного белка, включающего фрагмент большого Т-антигена. [c.183]

Рис. 6.4. Иммунопреципитация меченных 5-метионином экстрактов клеток СУ-1, инфицированных и псевдоинфицирован-ных вирусом 5У-40. Дорожки п —псев-доинфицированные клетки СУ-1, дорожки и — инфицированные клетки СУ-1. А — иммунопреципитация моноклональными антителами к большому Т-антигену Б — экстракты после иммунопреципитации сывороткой мыши, иммунизированной гибридным белком -галактози-даза — большой Т-антнген (аминокислоты 271—448), не взаимодействующим ни с одним из известных моноклональных антител к большому Т-антигену. Новые гибридомные клоны, продуцирующие моноклональные антитела, были получены в результате слияния с использованием спленоцитов такой мыши. (Рисунок взят из работы [9] приводится с любезного разрешения авторов.)

Справочник химика 21

Химия и химическая технология