Методы определения аффинности антител

Методы определения аффинности антител [c.41]

Таблица 2.1. Методы определения аффинности антител

Аффинность антител. Традиционные методы определения аффинности антител, позволяющие вычислять константу равновесия, основанные на изучении связывания меченого антигена с антителами, был и изложены в гл. 2, 3. В основном в таких экспериментах применяются иммобилизованные антитела и антигены, ме- [c.159]

Сушествует ряд методов определения аффинности антител и авидности антисывороток. Проце- [c.156]

Перечень экспериментальных методов определения аффинности взаимодействия антиген — антитело приведен в табл. 2.1. [c.44]

Титр антисыворотки сильно зависит от концентрации антигена, используемого дл я тестирования и от способа его определения. Например, одна и та же сыворотка может иметь титр 100 в тесте иммунопреципитации и 100 000 в тесте иммуноферментного анализа. Поэтому при тестировании сыворотки и определении титра лучше всего применять тот же метод, что и при анализе, а концентрацию антигена выбирать близкую к минимальной в том диапазоне, который выбран для анализа. Кроме того, следует учитывать, что в иммуноферментном анализе используют как гомогенные, так и гетерогенные методы определения концентрации антигена, которые могут сильно отличаться по структуре образующихся иммунных комплексов. В частности, в твердофазных методах вероятность образования циклических комплексов антиген — антитело значительно меньше, чем в гомогенных, а следовательно, и Наблюдаемая аффинность антител в обеих системах будет разная. [c.158]

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз. и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография но сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде. Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000-10000 раз). [c.213]

Во многих случаях необходимо или желательно получить очищенные с помощью аффинных методов антитела, специфические по отношению к определенному антигену. Ниже приводятся детальные методы фракционирования антисыворотки к гибридным белкам, позволяющие получать антитела, специфичные по отношению к гетерологичному фрагменту белка. Общая схема выделения специфических антител приведена на рис. 5.8. [c.165]

Ценность антител к компонентам клеточной поверхности заключается не только в их способности селективно уничтожать или идентифицировать клеточные популяции, но и в возможности определения конкретных молекул-мишеней. В настоящее время с помощью антител можно выделить компоненты, входящие в состав клеточных мембран, и определить их природу путем аффинного мечения после разделения в полиакриламидном геле. Такие методы лежат в основе современных исследований во многих областях клеточной биологии. [c.15]

НО актуальна при определении гормонов. Кроме того, обычно сыворотка содержит антитела к контаминирующим молекулам, находящимся в инъецируемой смеси, которые могут присутствовать в исследуемых образцах. Аффинная очистка на колонке с антигеном может в ряде случаев оказаться полезной (увеличить концентрацию, эффективность мечения антител, снизить фон), но не оказать влияния на специфичность по изложенным выше причинам. Данный метод не позволит [c.93]

Высокая специфичность моноклональных антител позволяет создать иммуноферментные диагностику мы для определения антигенов, которые имеются в ограниченных количествах или же недоступны в очищенном состоянии. В таких случаях для иммунизации животных и получения гибридом может быть использован препарат, содержащий около 1 % антигена. Высокоочищенный антиген необходим на стадии тестирования гибридом однако при наличии высокочувствительного метода определения нужные количества антигена исчисляются несколькими микрограммами. После получения гибридомы антиген может быть выделен методом аффинной хроматографии на моноклональных антителах. Полученный в вы-сокоочищенном состоянии в значительных количествах антиген в дальнейшем может быть использован в составе иммуноферментных диагностикумов. [c.170]

Отбор моноклональных антител по константам связывания с антигеном. Для количественного определения антигенов, содержащихся в биологических жидкостях в низких концентрациях, необходимо иметь моноклональные антитела с высокими константами аффинности. При этом для отбора соответствующих гибридом на сравнительно ранних стадиях их получения важно, чтобы применяемые методы определения констант не зависели от больших количеств антител. Достаточно удобным для этих целей является ранее описанный выше метод Фрикста. [c.175]

Результаты определения абсорбции антител к ОХ-45 тканевыми гомогенатами, представленные на рис. 5.6, Л, показывают, что антигенная активность ткани селезенки в пересчете на 1 мг белка примерно вдвое превышает антигенную активность тимуса и в 20 раз — активность мозговой ткани. На рис. 5.6,5 представлены результаты определения абсорбции антител препаратом несолюбилизированных мембран крысиных спленоцитов и дезоксихолатным экстрактом тех же мембран. Дезоксихолат несколько смещает кривую торможения связывания антител в сторону уменьшения антигенной активности в расчете на белок, однако данный метод анализа вполне пригоден для определения сорбции и выхода антигена в процессе аффинной хроматографии. [c.184]

Нужная концентрация антител определяется тремя независимыми критериями. Во-первых, она должна быть по крайней мере в 10 рдз ниже концентрации эпитопов, чтобы обеспечить условия, далекие от насыщения эпитопов даже при более чем 90%-ном связывании антител. Во-вторых, самая низкая концентрация свободных антител должна еще находиться в пределах чувствительности метода. В-третьих, метод определения антител должен з итывать только их количество, а не суммарный эффекг количества и качества. Соответствие третьему критерию абсолютно необходимо для достоверности результатов, поскольку при гетерогенности антител фильтрат всегда будет иметь более низкую среднюю аффинность, чем исходная их популяция. Наиболее чувствительные методы, такие, как нейтрализация бактериофагов через конъюгированные с ними антигены или обычные ра-диоиммунологические методы, не удовлетворяют этому требованию и дают систематические ошибки, завышая аффинности и занижая концентрации реагентов. Третий критерий, разумеется, не относится к равновесию моноклональных антител, для измерения которых лучшим из одинаково точных методов будет тот, который наиболее чувствителен. [c.36]

Наблюдаемый характер влияния аффинности на титрование по методу ELISA существенно зависит от способа графического представления результатов. К сожалению, результаты титрования часто изображают в полулогарифмических координатах, что лишь усложняет выявление характера влияния аффинности антител. В то же время, если произведение параметра /С , отражающего аффинность антител, и концентрации антигена близко к 100 или выше, то отношение К [Аг]/(1+К[Аг]) стремится к единице. Это означает, что в системе практически не будет наблюдаться различий в связывании антител, аффинность которых выше определенного значения, в свою очередь зависящего от концентрации свободного антигена. [c.233]

Обзор современных подходов. Для измерения абсолютных количеств антител было предложено по меньшей мере четыре различных метода, С применением каждого из этих методов связаны определенные теоретические и (или) практические проблемы. Метод сравнения со стандартом основан на исполь зовании стандартной сыворотки (содержание антител в ней установлено по независимым критериям), с которой сопоставляют содержание соответствующих антител в исследуемых образцах, Этот метод дает достоверные результаты, только если значения аффинности антител в сыворотке и в стандарте находятся в диапазоне, для которого связывание не зависит ог аффинности (см, выше). Величина ошибки, которая привносится из-за такого допущения, была выявлена в цитировавшихся ранее специальных исследованиях (Butler et al,, 1978). При использовании мультивалентных антигенов важно, чтобы антитела образца и стандарта обладали одинаковой специфичностью. Так называемый прямой метод ELISA основанный на исполь- [c.237]

Аффиная хроматография является самостоятельной областью жидкостно-адсорбционной хроматографии, выделяемой по специфическому механизму взаимодействия разделяемых веществ с сорбентом. Метод основан на характерной особенности биологически активньгх веществ селективно и обратимо связывать определенные вещества, называемые аффинными лигандами или аффиантами. Таким образом, ферменты связывают соответствующие ингибиторы, антитела — антигены, гормоны — их рецепторы и т.п. Если по аналогии с обращенными фазами приготовить сорбенты с привитыми аффинными лигандами, появляется возможность селективного хроматографического выделения близких по свойствам биологически активных соединений и их разделения между собой. Наиболее часто применяемые аффинные лиганды приведены в табл. 3.65. [c.201]

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Для определения количества специфичных к гибридному белку антител, присутствующих в сыворотке, и для получения препарата антител, не загрязненного антителами к -галактозидазе, антисыворотку к гибридному белку сначала наносят на аффинную колонку, содержащую иммобилизованную -галактозидазу. Для подготовки такой колонки используют 5—7 мг очищенной -галактозидазы Е. oli (Sigma) диализованной против PBS. Метод подробно приводится в табл. 5.6. [c.165]

Применение аффинной хроматографии в качестве метода изучения взаимодействий находится еще на ранней стадии развития, несмотря на то что количественная аффинная хроматография была введена уже десять лет назад [1—3]. Действительно, количество исследований, касающихся методологических аспектов аффинной хроматографии, примерно равно количеству сообщений по применению этого метода в конкретных экспериментальных системах. Большинство этих исследований способствовало применению аффинной хроматографии для оценки равновесия с участием ферментов и модификаторов, ингибиторов или субстратов [1—12], но метод был также использован и для характеристики взаимодействий белок — лекарственный препарат [13], система антиген — антитело [14] и, в меньшей степени, белок-белковых взаимодействий [15, 16]. По существу метод заключается в иммобилизации биоспецифической реагирующей группы X на инертной хроматографической матрице (например, часто на сефарозе) и определении средневзвешенных величин объема элюирования Уа распределяющегося растворенного вещества А в ряде хроматографических экспериментов, в которых растворенное вещество мигрирует в присутствии различных концентраций лиганда 5, также специфически взаимодействующего с А и/или X, В некоторых примерах различные изменения значения Уа отражали конкуренцию между растворенными и иммобилизованными реагентами за одно и то же положение в А [2—5, 7—14] в других изменения в величинахГд были обусловлены наличием взаимодействия иммобилизованного реагента X с бинарным А5-комплексом, образованным растворенным веществом и растворимым лигандом [1, 6]. Цель количественной аффинной хром ографии — объяснить возникновение изменений в величинах Га в предложении существования тех или иных равновесий. Поскольку положение равновесия зависит от концентрации (в соответствии с законом действия масс), точное определение состава смеси реагентов, к которой относится Га, обеспечивает применение фронтальной хроматографии [3, 4]. [c.192]

Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соеди-ненцй. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их РаЬ-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий. [c.101]

Определение титра аитисыворотки. Титр — это эффективная величина, характеризуюи ая связывающую способность антител, зависящая от их концентрации и аффинности. Абсолютное значение титра также зависит от метода и условий проведения эксперимента (температуры, времени, pH и т. д.) и от начальной концентрации свободного антигена. [c.157]

Отсюда определенный интерес представляет использование в анализе иммуносорбентов, полученных путем аффинного связывания специфических антител с иммобилизованным на носителе антигеном. Связь антиген — антитело обратима, поэтому для предотвращения смывания антител с сорбента разработаны пути последующего ковалентного закрепления молекул, образовавших специфический комплекс на носителе. Для стабилизации комплекса эффективно применяются обычные сшивающие агенты глутаровый альдегид, диазиды, изоцианаты. Процедура иммобилизации включает инкубацию связанного с носителем антигена с антисывороткой, отмывку носителя, проведение реакции с сшивающим антигеном и заключительную отмывку для удаления избытка (рис. 24). Процесс может проводиться как в реакторах перемешивания, так и в колоночном режиме. Данный подход детально изучен на примере иммобилизации антител против сывороточного альбумина человека на сефарозном сорбенте. В результате такого связывания по крайней мере половина активных центров иммобилизованных антител способна принимать- участие в последующих реакциях с антигеном, что является недостатком метода. Однако [c.210]

Определение концентрации иммобилизованных антител методически довольно сложно. Чаще всего для связывания с носителем используют IgG-фpaкцию иммунной сыворотки, точное содержание антител в которой неизвестно. Поэтому простое определение концентрации связавшегося с носителем белка не дает нужной информации. При иммобилизации аффинно выделенных антител, определив убыль белка из исходного раствора в процессе связывания и учтя количество антител, десорбировавшихся в результате промывок сорбента, можно найти суммарное количество молекул, присоединившихся к носителю. В результате подобных экспериментов может быть установлена емкость носителя, т. е. количество молекул антител, которое при данном методе иМ- [c.217]

Для разных целей требуются сыворотки с различными свойствами, поэтому нельзя разработать единый способ иммунизации животных, который бы гарантировал получение продукта, идеально удовлетворяющего всем требованиям. Тем не менее существуют определенные принципы получения антител, которые могут быть приняты за основные правила . Идеальные антисыворотки получают в определенной степени методом проб и ошибок, поскольку каждый иммуноген отличается от других и процесс образования антител у каждого животного имеет свои особенности. Необходимые свойства антисыворотки — это высокий титр в сочетании с высокой средней авид-ностью, а также специфичность. Первые (на которые оказывают влияние различные адъюванты) зависят от достижения баланса между неограниченной стимуляцией антиген-чувстви-тельных клеток в лимфоидных тканях животных при условии персистирования иммуногена, с одной стороны, и от конкуренции между клетками за лимитированное количество антигена таким образом, чтобы отвечали лишь клетки с наибольшей аффинностью,— с другой. Специфичность же критически зависит от чистоты иммувогена, поскольку даже небольшие примеси могут вызвать непропорционально сильное антителообразование. [c.33]

Большое разнообразие макромолекул, изучаемых с помощью антител, включает не только естественные продукты животных н растений, но, и продукты микробного происхождения, и синтетические вещества. Приготовление поликлональной антисыворотки к определенным молекулам может включать предварительную очистку, если нельзя получить очищенный коммерческий препарат. Для компонентов клеточной поверхности современный подход — это получение моноклональных антител требуемой специфичности при этом решается проблема очистки иммуногена (см. гл. 3). С другой стороны, с помощью уже существующих антител можно очистить компоненты клеточной поверхности, а также проводить обогащение клеток, экспрессирующих антиген-мишень. Эти подходы обсуждены в гл. 5. Метод экстракции имеет большое значение в тех случаях, когда необходимо получить полиспецифическую антисыворотку к смеси иммуногенов, например экстрагированных клеточных мембран, гомогенатов тканей, разрушенных ультразвуком бактерий, вирусов и паразитов. Невозможно в этой главе привести детальное руководство по экстракции и очистке огромного разнообразия иммуногенов. Существует специальная литература, посвященная методам получения углеводных, бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных антигенов [21]. Очистка с помощью аффинной хроматографии описана в гл. 5, а приготовление иммуноглобулинов [c.50]

Антисыворотки к подклассам IgA и IgG могут быть получены с помощью гибридомной технологии. Готовые к применению аффинно очищенные антитела могут быть использованы как в качестве им муногенов, так и в качестве сорбирующих антигенов. При этом простота в определении изотипов моноклональных антител сочетается с возможностью успешного получения специфической преципитирующей антисыворотки. Сыворотки получают, вводя животному интактные молекулы Ig илн F -фрарменты, затем их истощают на колонках со смесью других изотипов, содержащих как х-, так и Я-цепи. Получение чистого IgGaa мыши для иммунизации и адсорбции может быть осуществлено физико-химическими методами (разд. 10.6.1). [c.104]

Недостатки метода столь же многочисленны. Во-первых, приемлемые размеры антигенных частиц ограничены снизу наименьшим размером пор, еще пропускающих антитела, а сверху — необходимостью обеспечить нужную плотность эпитопов и при этом избежать блокирования фильтра. Во-вторых, метод не годится для измерения малых аффинностей — по той же самой причине, что большое количество антигена может блокировать фильтр. В-третьих, поливалентность крупных антигенных частиц при равновесной фильтрации порождает те же проблемы, что и при равновесном диализе. В-четвертых, метод основывается на сравнении титров антител и, следовательно, не может претендовать на точность, присущую химическим измерениям. В-пятых, он требует специальных приемов для раздельного определения количества и качества антител. [c.39]

В препаратах конъюгатов, полученных ковалентным присоединением фермента к антителам, часто присутствует некоторый избыток свободного фермента. Наличие примеси свободного фермента может заметно снизить чувствительность анализа за счет неспецифического превращения субстрата. Удаление из- бытка фермента дает возможность значительно повысить уровень чувствительности. Так, чувствительность определения поверхностного антигена вируса гепатита В методом ELISA удалось повысить в 50 раз с помощью очистки конъюгата аффинной хроматографией и гель-фильтрацией (Porstmann et ai., [c.181]

Практически влияние аффинности может выражаться в недооценке антител с низкой аффинностью (Butler, 1981 Butler et al., 1978). Утверждалось даже, что это обстоятельство сделает метод вовсе непригодным для количественных определений (Sips, 1948). Все же имеющихся на сегодня данных явно недо - [c.233]

Мы не можем с уверенностью сказать, в чем причина более высокой эффективности уабаинсодержащего сорбента по сравнению с дигоксинсодержащим. Теоретически можно было бы ожидать более высокой эффективности от аффинной колонки, полученной на базе самого антигена (или гаптена), а не его-аналога, особенно такого, для которого константа связывания с антителами более чем в 10000 раз ниже, чем константа связывания антигена. Такое представление основано на предположении, что на колонке будет сорбироваться только избыток свободных меченых антител, не связавшихся с молекулами свободного антигена в тестируемом образце. При скорости потока через колонку 34 мкл/с время пребывания комплекса [анти-г,ен — антитело] в контакте с сорбентом составляет лишь 17 с. По сравнению с константой первого порядка скорости диссоциации такого комплекса, составляющей -- 2 10 с , это время сравнительно мало. (Константа связывания антител с дигоксином, определенная методом равновесного связывания, составляет 5 10 л-МОЛЬ . ) В настоящее время мы исследуем возможности применения аналогичного подхода для определения других антигенов. Это могло бы оказаться весьма удобным для создания систем диагностического тестирования антигенов, которые доступны лишь в очень ограниченных количествах или с трудом поддаются очистке, таких, как малодоступные белковые антигены типа полипептидных гормонов или раковых опухолевых маркеров. В подобных случаях для иммобилизации вместо чистого (или частично очищенного) антигена можно было бы использовать синтетический пептидный фрагмент, полученный с помощью автоматического пептидного синтеза или методов молекулярного клонирования. Такие фрагменты могли бы выступать в роли относительно недорогих аналогов антигена для получения аффинного сорбента. [c.253]

Смотреть страницы где упоминается термин Методы определения аффинности антител: [c.102] [c.499] [c.232] [c.242] [c.368] [c.302] [c.44] [c.11] [c.224] [c.188] [c.159] [c.23] [c.145] [c.180] [c.262] [c.157] [c.239] [c.252] [c.255]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология