Окрашивание перед электрофорезом

Обработка агаровых пластинок. После окончания электрофореза ток выключают, предметные стекла с агаровым гелем тотчас извлекают из камеры и помещают на 30 мин в 5%-ный раствор СНзСООН. Каждую пластинку покрывают листочком фильтровальной бумаги, смоченным в 5%-ном растворе СНзСООН, для удаления воды и солей и высушивают при комнатной температуре в течение ночи. Для ускорения высушивания его проводят при температуре 37 °С или под струей теплого воздуха. Бумагу, приставшую к агаровой пленке, осторожно снимают, предварительно смочив ее водой. Перед окрашиванием агаровое поле должно быть совершенно сухим и прозрачным. Окрашивание белков на электрофореграммах проводят амидовым черным 10 Б в течение ночи. Не связавшийся с белком краситель отмывают 5%-ным раствором уксусной кислоты. Отмытые электрофореграммы высушивают при 37 °С. [c.93]

Метод включения в гель субстрата или затравки. При использовании высокомолекулярного субстрата или затравки инкубация геля в растворе субстрата дает лишь весьма посредственные результаты, поскольку субстрат плохо проникает в гель и реакция происходит только на его поверхности. Проблема может быть решена путем включения субстрата в гель перед проведением электрофореза. В этом случае гели после электрофореза инкубируют в буферном растворе с подходящим значением pH или во влажной камере, а затем проводят окрашивание макромолекулярного субстрата. После обесцвечивания гелей в местах локализации фермента выявляются бесцветные или менее интенсивно окрашенные полосы. При использовании техники включения субстрата в гель должны выполняться два [c.280]

Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом. Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электрофореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном растворе формальдегида в 25%-НОМ этаноле с добавлением СВВ R-250 до 0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пептиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мостиков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть разительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных белков гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном рас- [c.93]

Метод окрашивания полисахаридов перед электрофорезом [478] использовали Павленко и Оводов [479] для анализа ряда нейтральных и кислых полисахаридов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Для разделения различных компонентов полидисперсных декстранов и амилопектинов с помощью диск-электрофореза ими использованы буферы, содержащие тетраборат натрия (или борную кислоту), трис(гидроксиметил)-аминометан и натриевую соль ЕВТА при pH 9,2—9,3. Электрофорез в полиакриламидном геле используют также для анализа пектиновых веществ [480] и сульфатированных полисахаридов из морских водорослей [481], однако основной областью применения данного метода в химии углеводов является исследование гликопротеинов [482] и гликозаминогликанов (483, 484]. В по- [c.75]

Другой реакционноспособный краситель —ремазоловый яркий синий R (реактивный синий 19, .I. 44035) был применен> для окрашивания белков перед электрофорезом [480]. Так как-обработка белков этим красителем приводит к снижению их растворимости в отсутствие ДСН, данную методику предварительного окрашивания следует использовать лишь при электрофоретическом разделении белков в присутствии детергента [1247]. Предварительное окрашивание белков сыворотки крови этим> красителем в условиях, в которых не происходило осаждения белков, вызывало изменение их поведения при электрофорезе [277]. [c.275]

Из-за сложности манипулирования с мягкими гелями большинство исследователей предпочитает окрашивать липопротеиды перед электрофорезом (предварительное окрашивание). С этой целью краситель включают в стартовый гель или смешивают с образцом и перед электрофорезом центрифугируют [1066, 1445]. Недостаток методов предварительного окрашивания состоит в том, что они не позволяют достаточно надежно определять хиломикроны. Стартовый гель может окрашиваться избытком красителя, не связанного с липопротеидами, в результате чего создается ложное впечатление присутствия на электрофореграмме хиломикронов [373, 1445]. Чтобы облегчить визуальное обнаружение хиломикронов, Наито и др. [899] рекомендуют использовать для предварительного окрашивания разбавленный раствор суданового черного в этиленгликоле и одновременно снижать концентрацию рибофлавина в стартовом и концентрирующем гелях. Маскет и др. [830] предотвратили появление ложных зон хиломикронов, применив раствор суда-нового черного В в водном растворе диэтиленгликоля. Для поддержания красителя в растворенном состоянии они добавляли небольшое количество твина 20. Новый подход к предваритель- [c.358]

Реакция идет успешнее в щелочной среде. Продукт реакции имеет два максимума поглощения (при 300 и 390 нм) и максимум флюоресценции при 480 нм. Замечательно, что ни сам флюоресцамин, ни продукты его распада в растворе не флюоресцируют. При окрашивании белков и пептидов флюоресцамином не создается флюоресцирующего фона и окрашенный продукт можно не отделять от красителя, что чрезвычайно удобно. При использовании флюоресцамина для окраски белков или пептидов перед электрофорезом следует иметь в виду, что он вносит дополнительный отрицательный заряд (за счет образующегося карбоксила) и этим изменяет электрофоретическую подвижность окрашенного белка. В случае разделения белков, обработанных ДДС-Na, этот единичный заряд практической роли не играет. [c.99]

Окрашивание белка флюоресцамином перед электрофорезом было использовано значительно раньше [Eng, Parkers, 1 4]. Белок, обработанный ДДС-Na, растворяли до концентрации [c.99]

Окрашивание белка флюоресцамином перед электрофорезом было использовано значительно раньше [Eng, Parkers, 1974]. [c.99]

После завершения иммунодиффузии иммуноэлектрофорег-рамму можно сразу же сфотографировать без всякой обработки геля, причем лучше в рассеянном свете (при темнопольном освещении [952]). Кроме того, линии преципитации можно окрасить каким-либо белковым красителем. Перед окрашиванием непрореагировавшие белки необходимо отмыть солевым раствором. Для этого пластины геля вымачивают в течение 24—48 ч в солевом растворе, который несколько раз меняют. В последний раз гель промывают дистиллированной водой. Во время промывания слой геля может отделиться от стеклянной пластинки. Чтобы этого не произошло, стеклянную пластинку перед нанесением на нее горячего агарового золя следует покрыть тонкой. пленкой агара (на пластинку наливают разбавленный золь агара и дают ему высохнуть). После промывания гель накрывают полоской влажной фильтровальной бумаги, размеры которой на несколько сантиметров должны превышать размеры геля. Гель вместе с бумагой высушивают под вентилятором, а затем отделяют бумагу от высушенного слоя агара. Линии преципитации можно окрашивать практически любым красителем, применяемым для окрашивания белков после электрофореза в агаровом или агарозном гелях. [c.239]

Если полоски крахмального геля отбирают для иммунодиффузии путем сравнения с параллельной окрашенной полоской,, то следует учитывать, что гель сжимается в процессе окрашивания и обецвечивания. Для предотвращения ошибок на этом этапе Паулик [1030] рекомендует перед разрезанием блока геля на пластинки на его смежных сторонах вырезать через рдв-ные интервалы отверстия. При сопоставлении окрашенных и неокрашенных пластинок геля эти отверстия служат указателями для последующего вырезания участков геля, содержащих анализируемые антигены. Паулик провел иммунохимический анализ, выявив таким способом локализацию фракций, разделенных двухмерным электрофорезом в крахмальном геле [1030]. [c.244]

Большинство преципитирующих антител относится к классу иммуноглобулинов О (1дО), обладающих лишь очень слабым отрицательным зарядом при pH 8—9. Поэтому электроосмоти-ческий поток смещает 1 0 к катоду. Электроэндосмос заметно уменьшается при замене агара агарозой. Путем подбора определенных соотношений агара и агарозы можно регулировать скорость эндосмоса, создавая тем самым оптимальные условия для электросинереза. Очевидно, что антитела следует помещать ближе к аноду, а антиген — ближе к катоду. Если расположить рядом несколько лунок с антигенами, то последние можно сравнивать между собой подобно тому, как это делается в методе двойной иммунодиффузии [186]. Видимые линии преципитации образуются в течение 1—2 ч. Избыток реагентов удаляют, продолжая электрофорез после образования преципитатов. При этом нет надобности отмывать гель перед окрашиванием, что позволяет в течение 3—4 ч получить полную картину окрашенных полос преципитации. [c.247]

Пожалуй, наиболее широко для окрашивания белков используют амидовый черный 10 В (современные фирменные названия нафталиновый черный 12 В 200, нафталовый сине-черный б В, буффало черный, понтациловый сине-черный 8С или 5Х, С. I. 20,470). Этот краситель применяют для окрашивания белков после электрофореза на бумаге или в различных гелях. Его обычно растворяют в 7%-ной уксусной кислоте или в смеси уксусной кислоты, метанола и воды. В обоих случаях раствор перед употреблением обязательно следует профильтровать, поскольку крупинки нерастворившегося красителя могут давать ложное окрашивание. [c.266]

Дезоксирибонуклеазы можно обнаруживать так же, как и рибонуклеазы. Бойд и Митчелл, [156] добавляли к акриламиду субстрат (нативную или денатурированную ДНК) перед полимеризацией геля. После электрофореза гели инкубировали и окрашивали присутствующую в них ДНК метиловым зеленым. Этот метод позволяет обнаружить 250 пг панкреатической ДНКазы. При сканировании гелей на денситометре при длине волны 260—265 нм окрашивание гелей можно не проводить [155]. [c.294]

Бромистый этидий является интеркалирующим агентом и связывается с двухцепочечной нуклеиновой кислотой. Ультрафиолетовый свет, поглощенный бромистым этидием (300 нм) или ДНК (260 нм), но затем переданный бромистому этидию, испускается в виде флуоресценции при 590 нм. Наилучшее окрашивание получается, если перед проведением электрофореза нуклеиновых кислот в гель и в электрофо-резный буфер внести бромистый этидий в концентрации примерно 0,5 мкг/мл. Гель можно окрасить и после окончания [c.111]

Перед окрашиванием белки фиксируют, как обычно, осаждением кислотой, одновременно стараясь удалить из геля амфолиты. Необходимость этого обусловлена тем, что со многими белковыми красителями амфолиты образуют нерастворимые окрашенные комплексы. Обычно гель после ИЭФ вымачивают в течение 30—60 мнн в водном растворе, содержащем 3,5% суль-фосалициловой кислоты и 10,5% ТХУ (масса/объем). Затем гель в течение 15 мин промывают в водном растворе уксусной кислоты (8%) и этанола (25%). Окрашивают гель0,1%-ным раствором обычного для электрофореза белков красителя Кумас- [c.34]

Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13X14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндри-, ка геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ный раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. Прн этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен. [c.47]

В затвердевшем геле по шаблону вырезают центральное отверстие— лунку , а вокруг него еще 4 или 6 лунок, так чга расстояние между ними составляет 5—10 мм. Лунки вырезают трубочками с острыми краями диаметром 3—4 мм, а гель из них удаляют. Лунки заполняют до краев соответствующими растворами. Например, в центральную лунку наливают более или менее разбавленную антисыворотку, а в периферические — серию разбавлений исходного раствора антигена (рис. 29). Сыворотку и антиген разбавляют физиологическим раствором или тем же буфером. Это делается для подбора оптимального соотношения их концентраций (см. ниже). Затем пластинку помещают ва влажную камеру. Иммунодиффузию ведут иногда на холоду, а иногда при комнатной температуре или в термостате при 37°. Она продолжается не менее суток, а порою и несколько дней. Полосы преципитата можно наблюдать и фотографировать во-влажном геле на темном фоне при освещении пластинки снизу и сбоку. Они рассеивают свет и в прозрачном геле видны хорошо. Перед окрашиванием неосажденные белки вымывают в течение суток в двух — трех сменах 0,15 М раствора Na l. Полосы преципитата можно окрашивать точно так же, как было описано ранее для электрофореза и ИЭФ белков [Hu hzermeier et al., 1980]. [c.125]

Использование ОФА для окрашивания комплексов белок— ДДС-Na перед их электрофорезом описано еще в 1973 г. [Wei-dekamm et al., 1973]. Реакцию проводили в 0,025 М Na-фосфатном буфере (pH 8,5) в присутствии 5% ДДС-Na и 2% р-меркап-тоэтанола. Сначала белок растворяли в этой смеси и прогревали при 100 для полной денатурации и восстановления, затем туда добавляли Vs объема 1%-ного раствора ОФА в метаноле и выдерживали в темноте 2—3 ч. [c.101]

Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него вносят ДНК (10 мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы для своего действия нуждаются в ионах Mg " , Са " или то в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофореза. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеиновых кислот—бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нуклеаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием ДДС-Na из геля вымьюают. [c.103]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология