Фракционирование фрагментов ДНК размером

Ларсон и соавторы в аналитических опытах на микроколонке (0,15 X 10 см) исследовали оптимальные условия для фракционирования рестриктов ДНК в системе ХОФ-5 при среднем давлении ( 33 атм) и скорости элюции 13 мл/ч. Наилучшее разделение 17 фрагментов размерами от 43 до 850 пар оснований получалось у них при использовании очень пологого линейного градиента (0,55—0,75 М K I) объемом 40 мл (220 Fj) в нейтральном буфере при температуре 43°. Повышение температуры, по их данным, затрудняет элюцию ДНК и растягивает ее профиль. Удается разделить фрагменты длиной 98 и 102 пары оснований, чего далеко не всегда можно добиться с помощью электрофореза. Длина липких концов рестриктов и их состав влияют на разделение, равно как и нуклеотидный состав ДНК и даже последовательность оснований. Подчеркивается нео - [c.173]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Выделение фракций. Закончив электрофорез, блок извлекают из ванны и, слегка подсушив, разрезают на фрагменты шириной 1 см. Каждый фрагмент переносят в центрифужную пробирку соответствующего размера и размешивают с 3 мл буферного раствора. Осадок крахмала отделяют центрифугированием, а в надосадочной жидкости определяют содержание белка и на основании этих данных строят кривую фракционирования. В соответствии с этой кривой нужные фракции объединяют. [c.84]

Фракционирование нуклеиновых кислот и их фрагментов электрофорезом в ПААГ и гелях агарозы отличается от фракционирования белков некоторыми характерными особенностями, вытекающими из различия природы этих биополимеров. Главное, что отличает нуклеиновые кислоты,— это неизменно отрицательный и значительный по величине суммарный электрический заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты. Величина этого заряда мало зависит от pH окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот, поэтому в подавляющем большинстве случаев фракционирование их при электрофорезе идет за счет различия размеров молекул, а. не их зарядов. [c.120]

Фракционирование (т.е. разделение) фрагментов ДНК по размеру и длине проводится с помощью электрофореза на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. (Чем короче фрагменты, тем быстрее они движутся). В результате каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения расстояния, пройденного им и стандартным (с известными размерами) отрезком ДНК. [c.36]

Фракционирование гомогенатов. Из гомогената можно выделить субклеточные частицы, как надмолекулярные (клеточные органеллы), так и отдельные соединения (ферменты и другие белки, нуклеиновые кислоты, метаболиты) (см. рис. 6.8). Например, с помощью дифференциального центрифугирования можно получить фракции ядер, митохондрий, микросом (микросомы — это фрагменты эндоплазматического ретикулума). Эти органеллы различаются размерами и плотностью и поэтому осаждаются при разных скоростях центрифугирования. После осаждения микросом в надосадочной жидкости остаются растворимые компоненты клетки — растворимые белки, метаболиты. Каждую из этих фракций можно разными методами фракционировать дальше, выделяя составляющие их компоненты. Из выделенных компонентов можно реконструировать биохимические [c.195]

Существует два основных метода получения фрагментов эукариотической ДНК подходящих размеров 1) физическое фракционирование частичного гидролизата и отбор фракции нужного размера (разд. 2.2.1.3) и 2) дефосфорилирование суммарного частичного гидролизата с последующим использованием естественного отбора по размеру за счет упаковки in vitro — отбираются фрагменты размером 35—45 т.п.н. (разд. 2.2.1.4). Первый метод более расточителен в плане исходного материала требуется приблизительно 300 мкг ДНК, чтобы получить [c.43]

В состав реакционной смеси для лигирования в объеме 10 мкл входят 1,5 мкг (4 мкл) ДНК после фракционирования по размерам, 1,5 мкг векторных фрагментов рННЬ (2 мкл 6-кратный молярный избыток) и НгО до конечного объема 8 мкл. Смесь инкубируют при температуре 70 °С 8 мин, после чего переносят на 30 мин в ледяную баню. Добавляют 1 мкл 10-кратного буфера для лигирования и 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4. Перемешивают на вортексе, центрифугируют в течение короткого времени и инкубируют при 15 °С 2 ч. Результаты лигирования проверяют в 0,6%-ном агарозном мини-геле, нанося образец вместе с нелигированной векторной ДНК и маркерными фрагментами ДНК фага X. [c.23]

Космидные библиотеки генов состоят из меньшего числа клонов, чем библиотеки на основе векторных фагов Я (см. табл. 2.1). Однако последние все же предпочтительнее в тех случаях, когда не требуются фрагменты размером более 20 тпн. Это связано с некоторыми техническими сложностями, возникающими при конструирован библиотек генов на основе космид. Так, оказалось, что при этом происходит лигирование векторов друг с другом (см. рис. 2.20), что дает высокий фон клонов, не содержащих вставок чужеродной ДНК. Кроме того, скрининг большого числа колоний бактерий проводить сложнее, чем фаговых бляшек. Клонированные крупные фрагменты в составе ДНК фага более стабильны, чем в космидах, поскольку репликон фага адаптирован к поддержанию молекул большого размера. Важно отметить, что для предотвращения встройки в космидный вектор нескольких несоседних на геноме фрагментов необходимо проводить фракционирование клонируемой ДНК или дефосфорилирова-ние, как и в случае получения библиотек генов на основе фага Я. [c.105]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные гели. Агароза — это особо чистая фракция, получаемая из агара или непосредственно из агарообразующих морских водорослей. В 1,0% агарозном геле можно разделять молекулы ДНК размером от 600 до 20 ООО п. н. Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований), денатурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20% полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним нуклеотидом. [c.54]

Гель-фильтрация. Для фракционирования папаинового гидролизата примерно 100 мг IgG используют колонку размером 2х ХбО см. После нанесения препарата его остатки смывают тремя порциями буферного раствора по 4 мл и начинают гель-фильтрацию со скоростью 40—60 мл/час. На кривой оптической плотности элюата появляются два следующие непосредственно друг за другом пика, а через некоторое время после них — третий пик. Фракция элюата, соответствующая первому пику, содержит негидролизованный IgG (резистентные к папаину молекулы IgG). Во фракции, соответствующей второму пику, содержатся Fab- и F -фрагменты. Третья фракция, соответствующая на диаграмме третьему пику, состоит из низкомолекулярных пептидов. После пропускания через колонку одного объема буферного раствора ее можно использовать вновь. [c.224]

Для фракционирования олигорибонуклеотидов может быть также использован двумерный гель-электрофорез [127]. В ходе первой стадии электрофореза, которую проводят в 0,025 М лимонной кислоте, содержащей 6 М мочевину, происходит разделение олигомеров в соответствии с их размерами и нуклеотидным составом, а вторая стадия представляет собой обычный электрофорез при pH 8 [127].С помощью этого метода можно разделить олигомеры длиной до 80 нуклеотидных остатков. Путем сравнения картин распределения пятен ( отпечатков пальцев ), отвечающих разделенным с помощью двумерного электрофореза [и (или) гомохроматографии] олигорибонуклеотидам двух РНК, нуклеотидная последовательность одной из которых известна, можно оценить степень структурной гомологии этих РНК, а затем отобрать для дальнейшего анализа лишь такие олигорибонуклеотиды второй РНК, которые по подвижности не совпада-чют ни с одним из фрагментов РНК с известной структурой (рис. 10.11). [c.190]

Со5-картирование разработали Раквиц и др. [21] для картирования клонов фага к. Эта процедура используется также и в случае космидных клонов [6]. Основная проблема, возникающая при анализе космидных клонов путем рестрикционного картирования, связана с их размером у них слишком много сайтов для наиболее широко используемых ферментов, чтобы осуществить быстрое картирование. Со5-картирование обходит эту трудность, используя частичный рестриктазный гидролиз для идентификации сайтов и определения порядка их распределения. Схематично этот процесс показан на рис. 2.2. Левый или правый липкие концы метят, подвергая их отжигу с меченным P 12-членным фрагментом ДНК, комплементарным левому или правому липкому концу фага К. Затем ДНК подвергают частичному рестриктазному гидролизу, а радиоактивные фрагменты путем определения стартового участка обнаруживают радиоавтографией после фракционирования их по размеру в-агарозном геле. При этом выявляются все фрагменты с меченым концом. [c.63]

Результаты фракционирования зависят от способа разрушения, состава среды и типа клеток, так как эти факторы определяют характер разрыва мембран и, следовательно, размеры образующихся фрагментов. Так, при непродолжительной гомогенизации из плазматических мембран получаются довольно крупные фрагменты, осаждающиеся вместе с ядерной фракцией. В этом случае мик-росомальная фракция содержит небольшое количество везикул, образованных из клеточной мембраны. Если при гомогенизации получаются мелкие пузырьки, то отделить фрагменты наружной [c.65]

Проверьте эффективность Л оЛ-библиотеки. Это несколько проще, так как у значимых клонов обе половинки, составляющие прыжок, должны происходить из одного и того же Notl-фрагмента. Целесообразно идентифицировать 5—10 клонов, содержащих вставки уникальных последовательностей, а затем проверить обе половинки каждого клона- прыжка путем блот-гибридизации с ДНК, фракционированной пульс-электрофорезом. Это даст представление о варьировании размеров прыжков, представленных в библиотеке, а также о доле значимых прыжков. [c.116]

Фракционирование нуклеиновых кислот путем электрофореза в агарозе — это наиболее удобный метод анализа как ДНК так и РНК. В данной главе изложен метод электрофоретического разделения ДНК, предварительно обработанной рестриктазами. Метод основан на том, что скорость миграции линейных молекул ДНК в электрическом поле пропорциональна их. длине. Таким образом, можно довольно легко разделить фрагменты ДНК разной длины, а также определить размер, сравнивая скорость их миграции в геле с маркерными ДНК известного размера. Полосы ДНК видны при освещении ультрафиолетом после окрашивания геля флуоресцирующим интеркали-рующим красителем бромистым этидием в низкой концентрации. Такой метод окрашивания обладает большой чувствительностью и позволяет обнаруживать зоны, содержащие всего [c.280]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология