Белки нативные, обнаружение

Детальное представление о нативных конформациях белков основано почти исключительно на результатах рентгеноструктурного анализа. Спектральные методы конформационного исследования белков в растворе пока не имеют в определении геометрии макромолекул самостоятельного значения. Однако они могут быть полезными в изучении ряда свойств белков и обнаружении связанных с ними новых явлений. Так, некоторые спектральные методы чувствительны к конформационным состояния.м, внешнему окружению и изменениям положений атомных групп в структуре белковой макромолекулы и даже к небольшим перемещениям отдельных атомов. Интерпретация подобных фактов тем не менее осуществляется в основном с помощью рентгеноструктурных моделей. [c.340]

При изучении эффекта Керра [119], а также при исследовании спектров флуоресценции 7-глобулина [1201 показано, что 90% ароматических остатков спрятаны внутри глобулы и находятся в гидрофобном окружении. При подробном изучении дифференциальных УФ-спектров 7-глобулина Окуловым и Троицким [1211 обнаружено, что примерно 17 остатков тирозина (из 56) и 3 остатка триптофана (из 22) расположены на поверхности нативной глобулы 7—8 тирозинов расположены в щелях глобулы и больше половины тирозинов (31—32) и подавляющая часть триптофанов находятся внутри глобулы. Авторами было замечено, что при pH 3 молекула 7-глобулина может набухать , что приводит к повышению доступности хромофоров без разрушения упорядоченных структур молекулы. Это, вероятно, связано с частичным разрушением глобулярной (третичной) структуры без нарушения вторичной. Если при этом частично или полностью разрушаются гидрофобные области, то естественно, что связывание углеводорода должно уменьшаться. Вероятно, такое поведение (существование частично развернутой формы белка) при изменении pH присуще всем глобулярным белкам. Однако для обнаружения этих форм недостаточно изучения только вязкости и оптической активности. Очень важную информацию может дать исследование связывания углеводородов. Дальнейшее увеличение заряда с изменением pH среды приводит белковую молекулу к состоянию, соответствующему полной дезорганизации глобулы, разрушению ее третичной и вторичной структуры, т. е, к состоянию клубка. [c.26]

При денатурации белка выявляются некоторые химически реактивные группы, которые в нативном белке не полностью доступны для обнаружения обычно применяемыми методами. Эти замаскированные группы обнаруживаются только при денатурации. К ним принадлежат, например, группы 5Н и некоторые другие (фенольные группы тирозина, циклические ядра гистидина и триптофана). Следует отметить, что целый ряд белков и в нативном состоянии содержит свободные реактивные ЗН-группы, но при денатурации количество их возрастает. [c.18]

Денатурация белков возможна не только в модельных условиях, но и в условиях живой клетки. Поскольку из-за высокой концентрации белков во внутриклеточном пространстве осуществляется ассоциация, а затем агрегация денатурированных белковых молекул, то возможность самопроизвольной ренативации белков in vitro затруднена. Для восстановления нативной конформации частично денатурированных молекул в живых организмах существуют специфические белки — шапероны, обнаруженные как белки, активно синтезирующиеся в условиях теплового шока организма. Классификация шаперонов основана на различиях в молекулярной массе их субъединиц. Высокомолекулярные шапероны имеют массу от 60 до 100. Из них наиболее исследованы три семейства родственных белков Ш-60, Ш-70 и Ш-90. Кратко остановимся на особенностях их функционирования. [c.76]

В процессе выделения фермента из дрожжей происходит частичное отщепление от него тиаминпирофосфата. Полное отделение можно получить, выдерживая фермент в щелочной среде (pH 8,0) или путем диализа против раствора ЭДТА. Взаимодействие кофермента с апо-ферментом осуществляется при участии ионов двухвалентных металлов, таких как Mg +, ea +, Мп2+ и др. В нативной холотранскетолазе обнаружен только кальций в количестве 2 г-атом на моль белка. [c.279]

В расчете БПТИ учитывались внутримолекулярные ван-дер-ваальсовы электростатические и торсионные взаимодействия, а также водородные связи. Каковы же вклады этих взаимодействий в энергию нативной конформации белка Аминокислотная последовательность БПТИ включает 18 остатков, несущих 12 положительных и 13 отрицательных целочисленных зарядов. Стабилизирующий вклад электростатических взаимодействий заряженных остатков составляет около -50 ккал/моль, а дестабилизирующий - -1-35 ккал/моль. Следовательно, хотя электростатические взаимодействия и понижают конформационную энергию приблизительно на 15 ккал/моль, их интегральный вклад в стабилизацию структуры БПТИ невелик (5%). Суммарный стабилизирующий эффект водородных связей составил около -14 ккал/моль, т.е. < 5%. Обнаруженные в расчете водородные связи обусловлены сложным комплексом многих межостаточных взаимодействий, среди которых собственно водородные связи играют незначительную роль. Общая энергия торсионных взаимодействий в найденной конформации БПТИ равна около -1-58 ккал/моль, те -10 ккал/моль на остаток. Из этого следует, что взаимные расположения практически всех атомных групп основных и боковых цепей аминокислотных остатков отвечают минимумам торсионных потенциалов. Таким образом, доминирующий вклад (75%) в конформационную энергию межостаточных взаимодействий белка вносят ван-дер-ваальсовы, точнее, дисперсионные контакты. [c.468]

Вернемся теперь к ренатурации молекулы БПТИ. Обнаруженная Крейтоном [7] в самом начале этого процесса статистическая смесь моно-85-продуктов может быть смело отнесена к добифуркационному этапу сборки, когда еще не сложились автономные конформационно жесткие структуры и состояние белковой цепи почти полностью определялось обратимыми флуктуациями. Через короткое время селекция беспорядочных конформационных отклонений привела к возникновению на участках Лг -Рго (см. рис. 1У.7), РНе 2-01п (см. табл. 1У.7) и А1а" -01у стабильных пространственных форм, а на промежуточных участках последовательности БПТИ к немногочисленным наборам структурных вариантов. После уменьшения конформационной свободы продукты с одной дисульфидной связью в денатурированной цепи уже не могут оставаться равновероятными. Существовавшая ранее статистическая смесь 15 моно-58-продуктов автоматически дифференцируется по энергии. В результате, как показывает опыт, наиболее предпочтительными оказываются два продукта. Один из них содержит связь Су5 °-Су5 , а другой-Су5 —Су5 °, отсутствующую в нативной конформации белка (рис. IV. 17). Интересно то обстоятельство, что остатки Су5 , Суз и Суз , образующие дисульфидные связи в самых предпочтительных моно-55-про-изводных, входят в конформационно жесткие фрагменты 1-9,22-31 и [c.475]

Субтилизин был получен в кристаллическом виде Гунтле-бергом и Оттезеном [130] из среды, в которой выращивался штамм В. 8иЫШ8. Первоначально этот протеолитический фермент был обнаружен по его способности вызывать ограниченный гидролиз нативного овальбумина, сопровождающийся образованием другого способного кристаллизоваться белка — плакальбумина [200] — и гексапептида Ала.Гли.Вал.Асп.Ала. Ала [231]. [c.211]

Высокомолекулярная фракция была сконцентрирована в нативном состоянии с помощью сефадекса приблизительно в 30 раз, и при исследовании ее в ультрацентрифуге ФИВЕ на диаграмме седиментации был обнаружен один пик с константой седиментации ( 20,ж), равной 5,94 5. Таким образом, из секрета печеночных митохондрий выделено два усиливающих фактора, из которых один оказался адениннуклеотидом, а другой — белком. По-видимому, в первую очередь, когда гиалоплазма еще лишена коэнзимов гликолиза, действует аденнннуклеотид. Это действие дает гликолизу первый импульс. Затем, после насыщения ферментов коэнзимами, наступает действие белкового фактора это действие вызывает дальнейший подъем гликолиза. [c.115]

Вследствие рацемизации, происходящей при гидролизе (стр. 174), весьма трудно положительно решить вопрос о том, содержатся ли в белке неприродные изомеры. Прежде всего, обнаружение в гидролизате частично рацемизованной аминокислоты вовсе не является убедительным доказательством того, что в состав нативной молекулы белка входил d-нзомер. Однако более серьезным является то обстоятельство, что при етрочих равных условиях степень рацемизации различна в зависимости от того, находится ли данная аминокислота в свободном состоянии или же она связана пептидной связью. Поэтому тот факт, что какая-либо аминокислота в гидролизате окажется более ращвмизован- [c.110]

Другим примером связывания внешних поглощающих групп с биологической макромолекулой могут служить недавние исследования эффекта Коттона в полосе Соре гемоглобина и миоглобина [87, 88]. Эти два вещества являются комплексами белков с гемами, каждый из которых имеет характерную для порфиринов полосу поглощения около 410 ммк. В нативных молекулах в области этой полосы поглощения наблюдается типичный эффект Коттона (рис. 23), который исчезает при денатурации белка. Сходный эффект Коттона был обнаружен у комплексов гемина с синтетическим полипептидом, а именно с П0ЛИ-1--ЛИЗИН0М [89]. Этот эффект Коттона, так же как эффект Коттона у системы синтетический краситель — полипептид, зависит от конформации. [c.287]

Хотя в 1950-е годы еще не было известно пространственное строение на атомном уровне ни у одного белка, тем не менее в то время почти отсутствовало сомнение в том, что белковые молекулы построены из регулярных форм и главным образом из а-спиралей Полинга и Кори, обнаруженных в чистом виде у гомополипептидов. Именно на таком представлении о строении белков основана классификация белковых структур на первичную, вторичную и третичную, предложенная в 1952 г. К. Линдерстрем-Лангом [90]. Под первичной структурой понималась аминокислотная последовательность белка, т.е. его химическое строение, включая дисульфидные связи под вторичной структурой — полностью насыщенные пептидными водородными связями регулярные конформации белковой цепи как целого или ее отдельных участков. Набор взаимодействующих между собой регулярных конформаций а-спиралей, -структур и т.д. образует нативное пространственное строение белковой молекулы, названное Линдерстрем-Лангом третичной структурой. Таким образом, классификация Линдерстрем-Ланга, по существу, представляет собой формулировку принципа пространственной организации белков. Очевидно, разделение пространственной структуры белка на вторичную и третичную является условным и может иметь смысл только в том случае, если пространственное строение макромолекулы действительно представляет собой ансамбль сравнительно немногочисленных канонических форм полипептидов. В то время этот вопрос был далек от своего решения. Позднее иерархия структур Лин-дерстрем-Ланга пополнилась еще одной, четвертичной, структурой, характеризующей агрегацию белковых молекул или достаточно обособленных субъединиц. Примерами белков с четвертичной структурой могут служить гемоглобин, молекула которого состоит из четырех субъединиц, белок вируса табачной мозаики, представляющий собой систему из 200 одинаковых глобулярных молекул. [c.27]

После обнаружения целой гаммы промежуточных состояний на пути от полностью денатурированного белка к нативному Крейтон детально изучил кинетику изменений и взаимопревращений этих состояний в ходе свертывания и развертывания белковой цепи. Далее он выяснил оптимальные условия моментальной остановки процесса ренатурации БПТИ и гашения тиол-дисульфидной реакции обмена, а затем разработал способы фиксации и выделения промежуточных состояний, определения у них количества дисульфидных связей и мест их локализации в аминокислотной последовательности БПТИ. Таким образом, последующее изучение денатурации белка, а именно получение количественных данных о кинетике и термодинамике всех этапов процесса и доказательное описание механизма самоорганизации пространственной структуры белка in vitro, имеет серьезную основу, созданную Крейтоном в результате огромной целенаправленной подготовительной работы. [c.367]

При изучении свертывания рибонуклеазы большой интерес вызвал факт более быстрой реставрации дисульфидных связей по сравнению с восстановлением ферментативной активности белка. Он был обнаружен Анфинсеном и соавт. [79] в 1961 г. при окислении денатурированной рибонуклеазы кислородом воздуха и объяснен образованием неправильных S-S-связей, которые со временем перераспределяются в правильные, что и лимитирует скорость укладки нативной конформации. Этому объяснению, однако, противоречило более позднее наблюдение того же Анфинсена за скоростью восстановления активности белка, которая оказалась обратно пропорциональной его концентрации [80]. Тогда было предположено образование денатурированными цепями рибонуклеазы межмолекулярных дисульфидных связей, которые со временем разрываются и переходят в правильные внутримолекулярные связи. Очевидно, что чем больше концентрация денатурированного белка, тем вероятнее ассоциация их молекул посредством S-S-связей и медленнее восстановление активности. Процесс окисления восстановленной рибонуклеазы кислородом воздуха оказался, таким образом, отягощенным побочными явлениями, не имеющими прямого отношения к механизму молекулярной реоксидации. [c.374]

Для обнаружения белков с давних пор применяют несколько проб, основанных главным образом на осаждении. Малые количества нативных белков можно обнаружить, применяя чувствительную микрореакцию, предложенную Файглем и Ангером [8], в которой появляется синяя окраска водорастворимых щелочных солей этилового эфира тетрабромфенолфталеина, окрашенного в желтый цвет. При действии разбавленной уксусной-кислоты эти соли превращаются в соответствующий фенол. При взаимодействии этого эфира с белками, находящимися обычно в коллоидном состоянии, появляется синее окрашивание (вероятно, образуется солеобразное соединение), устойчивое к действию уксусной кислоты. Появление такой же окраски наблюдается и при взаимодействии белков с другими индикаторами, что мешает анализу. [c.258]

Принято считать, что обработка белков ДСН вызывает у них сильные конформационные изменения, которые могут приводить к изменению структуры или к полной утрате антигенных детерминант и активных центров ферментов. В то же время без такой обработки невозможно добиться того, чтобы все белки несли отрйцательный заряд и мигрировали к аноду в условиях электрофоретического фракционирования и переноса. То, что обработанные ДСН белки после переноса проявляют антигенную активность, может объясняться их частичной ренатурацией после удаления додецилсульфата в ходе отмывки блота. Другое возможное объяснение заключается в том, что антигенная активность, обнаруживаемая на блотах, связана только с теми эпитопами белков, которые зафиксированы непосредственно на уровне первичной структуры. Не исключено, что возможность обнаружения антигенов после обработки ДСН и переноса в действительности обусловлена сочетанием обоих названных факторов. В пользу первого предположения свидетельствуют результаты обнаружения как нативных, так и обработанных ДСН белков с помощью различных моноклональных антител. Более того, нам удавалось непосредственно зарегистрировать фермен- [c.352]

Поскольку у злаков был обнаружен феномен перехода митохондрий в низкоэнергетическое состояние, представляло интерес установить спектры и состав иммунохимически родственных БХШ 310 белков злаков с различной степенью холодостойкости. В ходе экспериментов обнаружено, что в спектре нативных белков озимой ржи, пшеницы, кукурузы и пырейника имеется ряд относительно низкомолекулярных иммунохимически родственных ему белков с мол. массами 110-140 кДа, а также белок с мол. массой около 230 кДа (рис. 29,А). Белки с молекулярными массами около 480 и 310 кДа в значительном количестве были обнаружены только у озимой ржи. У пырейника обнаружен ряд белков с мол. массами 320 - [c.57]

Вестерн-блоттинг нативных белков показал у озимой ржи наличие ряда иммунохимически родственных БХШ 310 белков. В цитоплазме были обнаружены белки с мол. массами около 470 кДа, 310 кДа, около 230 кДа и ряд относительно низкомолекулярных белков с мол. массами около 140 кДа (рис. 15,А). В митохондриях, кроме белка 310 кДа, были обнаружены также все иммунохимически родственные БХШ 310 белки с меньшей мол. массой (рис. 30,А). В ядерной фракции был обнаружен ряд иммунохимически родственных БХШ 310 белков высокомолекулярные белки с мол. массами около 470 кДа и около 320 - 330 к Да, белок с мол. массой около 230 кДа и относительно низкомолекулярные белки с мол. массами около 140 кДа (рис. 30,А). При этом было обнаружено, что содержание белка с молекулярной массой около 320 - 330 кДа в ядерной фракции даже несколько превосходит содержание БХШ 310 в цитоплазме. [c.61]

В эксперименте было показано, что белки семейства БХШ 310, выделенные из пшеницы, кукурузы и пырейника, не обладают прооксидантной активностью (рис. 40). При этом, если белки, выделенные из пшеницы, не оказывали заметного влияния на ПОЛ, то белки, выделенные из кукурузы, и особенно из пырейника, вызывали значительное ингибирование во всех изученных системах ПОЛ более чем в два раза (рис. 40). По-видимому, обнаруженные отличия, касающиеся влияния белков данного семейства из разных видов растений на активность ПОЛ в митохондриях связаны с различиями структуры нативных белков, в связи с чем они по-разному ассоциируют с митохондриями и, следовательно, по-разному влияют на их энергетические функции и протекающие в митохондриях процессы перекисного окисления липидов. [c.82]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология