Гибридные рекомбинантные ДНК

Клонотека пептидов, полученная в результате реализации третьего подхода, в современном виде представляет собой набор десятков или даже сотен миллионов коротких различающихся последовательностей аминокислот, которые экспрессированы на поверхности вирионов бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Это становится возможным благодаря введению в геном бактериофагов гибридных рекомбинантных генов, кодирующих измененные структурные белки его вирионов. В результате экспрессии таких генов образуются гибридные белки, на М- или С-концах которых (см. ниже) присутствуют дополнительные последовательности аминокислот. В наиболее хорошо разработанной системе, позволяющей конструировать клонотеки пептидов генно-инженерными методами, используют не- [c.338]

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (шти химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком. [c.120]

Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся ири сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5 -концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка - продукта клонированного гена 3) гибридизацию с зондом, комплементарным како-му-либо участку искомого гена. [c.78]

Гибридная ДНК, искусственная молекула, составленная методами генной инженерии из участков разных природных ДНК. Тот же смысл имеют термины рекомбинантная и химерная ДНК. [c.154]

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

Дж. Уотсон и Ф. Крик, определив роль ДНК в процессе передачи наследственной информации в живых организмах, фактически заложили фундамент современной генной инженерии и биотехнологии. Буквально через 10 лет после знаменательного открытия структуры ДНК группа американских исследователей сообщила о выделении первой гибридной (или рекомбинантной) ДНК — молекулы, объединяющей в себе гены разных организмов. [c.495]

Рекомбинантная ДНК — гибридная молекула ДНК, содержащая искусственно введенный ген. [c.555]

Сигнальная гипотеза была проверена и в генетических, и в биохимических экспериментах. Доказана ее справедливость и для растительных, и для животных клеток. Эта гипотеза подтверждается и для случая переноса белков через плазматическую мембрану прокариот. Более того, N-концевые лидерные пептиды были обнаружены не только у секреторных белков, но и у предшественников белков плазматической мембраны и лизосом, которые также переносятся с помощью ЭР. Как отмечалось ранее, сигнальная роль этих лидерных пептидов была напрямую продемонстрирована с использованием техники рекомбинантных ДНК при присоединении сигнальных последовательностей к белкам, в норме их лишенных полученные гибридные белки направлялись в ЭР. [c.44]

ЛОТЫ (объемная концентрация) и 6 М гуанидин-НС1 это жесткие условия, которые, по-видимому, приводят к развертыванию молекул агрегировавших гибридных белков, делая связь аспарагин — пролин доступной для воздействия растворителя. Денатурирующие агенты удаляют с помощью диализа, заменяют их на подходящий буфер и создают условия, позволяющие молекулам бГР снова принять нативную конформацию. Одна из проблем, возникающих при таком подходе, состоит в том, что на М-конце рекомбинантного белка остается остаток пролина, [c.106]

Гибридные белки различаются по своей растворимости так же, как и по стабильности. Было исследовано шесть гибридных белков, кодируемых клонированными в pUR-векторах рекомбинантными генами, содержащими разные фрагменты большого Т-антигена вируса SV-40. Два из этих шести белков в основном обнаруживались в надосадочной фракции экстракта лизированных клеток, три — преимущественно в нерастворимой фракции экстракта и один — в одинаковой мере присутствовал в обеих фракциях. [c.178]

В заключение этого раздела следует упомянуть о возможности использования транс-сплайсинга белков для исследования белок-белковых взаимодействий в цитозоле прокариотических и эукариотических клеток [72, 73]. При таком подходе получают гибридные рекомбинантные белки путем слияния половинок зеленого флуоресцирующего белка (GFP) или люциферазы с двумя фрагментами расщепленного интеина. Другой конец одного из фрагментов интеина соединяют с белком-рецептором (приманкой), как это делается в классических системах дигибридного скрещивания у дрожжей, а у другого фрагмента - с большим количеством потенциальных белков-лигандов. В том случае, если между рецептором и лигандом происходит взаимодействие, два фрагмента интеинов объединяются друг с другом (см. выше, рис. 41) и осуществляют транс-сплайсинг, завершающийся образованием полноценного флуоресцирующего белка или люциферазы, что легко обнаруживается по изменению уровня флуоресценции инкубационной смеси. [c.316]

Двухцепочечный олигонуклеотид (а), содержащий вырожденные кодоны NNK и те же самые сайты рестрикции в составе линкеров, лигируют с ДНК вектора Fuse5 (б), расщепленного рестриктазой Sfil, с образованием рекомбинантного генома (в), который направляет синтез гибридного рекомбинантного белка (г), содержащего на N-конце указанную аминокислотную последовательность [c.341]

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в . соН, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид Е. соИ и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем вьщеленные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хозя-ину легко тестируемый признак. [c.124]

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. соИ (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3 -концу гена фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. соИ, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. [c.133]

В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наследственных и соматических болезней) широкое применение получили эндонуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двухцепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4-7-членные последовательности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фрагменты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (рекомбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.). [c.481]

Бактерии, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, защищают собственную ДНК от расщепления с помощью ферментов, метилирующих те участки молекулы, с которыми связывается соответствующая эндонуклеаза рестрикции. Однако геном клетки-хозяина не защищен от рекомбинантной рестриктазы Fokl, и чтобы предотвратить гибель растущих клеток, синтез гибридного фермента подавляли, поместив ее ген под контроль системы экспрессии бактериофага Т7. [c.174]

В. thuringiensis. Чтобы проверить, будет ли эта система функционировать в трансгенных растениях, был сконструирован фрагмент ДНК, кодирующий гибридный белок ингибитор протеиназ/укороченный токсин . Трансгенные растения табака, которые синтезировали небольшие количества такого рекомбинантного белка, были в значительной мере защищены от насекомых-вредителей. [c.394]

Обычно векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, которые мог т существовать и в Е. OU. и в той клетке-хозяине. для которой они предназначены. Это достигается созданием гибридных векторов, содержащих реп-ликон какой-либо из плазмид Е. oli и требуемый репликон, например плазмиды В. subtilis или дрожжей, что позволяет проводить первоначальное клонирование и отбор требуемых генов в хорошо изученной системе Е. oli, а затем уже вводить выделенные рекомбинантные плазмиды в новый организм. [c.439]

Генная инженерия возникла как результат всего развития науки о ДНК. Но событием, позволившим непосредственно приступить к перетасовке генов, было открытие ( зерментов рестриктаз. Рестриктазы узнают определенные, короткие последовательности нуклеотидов и разрезают молекулу ДНК в этом месте. Такие последовательности могут случайно встретиться в любой ДНК- Поэтому если подействовать какой-то рестриктазой на ДНК, скажем, мухи, а одновременно ею же на ДНК слона, то произойдет случайная перетасовка генов мухи и слона. Чтобы получились длинные гибридные, химерные или, как их еш,е называют, рекомбинантные молекулы, нужно лишь добавить фермент лигазу, сшиваюш,ий фрагменты ДНК друг с другом. Так в пробирке можно создать какие угодно комбинации генов, причем все они заведомо никогда не реализовались в живой природе из-за запрета на межвидовое скрещивание. [c.59]

Этот ПОДХОД был использован при клонировании гена соматостатина-пт-тщного гормона (14 аминокислотных остатков) из гипоталамуса, регулирующего секрецию инсулина, глюкагона и гормона роста. Ген соматостатина был в этом случае синтезирован химически и присоединен к концу гена 3-галактози-дазы. Два связанных между собой гена были встроены в плазмиду Е. соИ, и полученная рекомбинантная плазмида была введена в клетки Е. oli. В результате такие клетки синтезировали большие количества гибридного белка, состоящего из ковалентно соединенных друг с другом Р-галактозидазы и соматостатина. Такая молекула, представляющая собой гибрид собственного белка Е. oli и белка позвоночного организма, называется химерным белком. Гибрид р-галактозидазы и соматостатина расщепляли по пептидной связи, соединяющей два белка, что приводило к освобождению обладающего биологической активностью соматостатина. [c.988]

ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) — материальный носитель наследственных признаков, тип молекул, способных к самоконирова-нию и воспроизводству генетической информации нитевидная молекула биополимера, присутствующая в ядрах всех эукариот, где упакована в хромосомы нить образована чередующимися молекулами моносахарида (дезоксирибозы) и фосфатов, соединенных ковалентными связями с азотистыми основаниями существует как в виде одной нити, так и в форме двойной спирали за счет комплементарного спаривания А—Т, Г—Ц рекомбинантная (гибридная) ДНК — объединение чужеродных фрагментов. [c.188]

Гибридные гены можно конструировать таким образом, что детерминируемые ими чужеродные белки будут локализоваться в цитоплазме клеток Е. oli либо, если лидерную последовательность встроить перед кодирующей, будут секретироваться наружу через клеточную мембрану. Как правило, когда рекомбинантные полипептиды остаются в клетке, они накапливаются в больших количествах (до 25% от суммарного белка клетки), чем когда они секретируются клеткой (менее 1 % суммарного белка клетки). Однако многие полипептиды, экспрессируемые в цитоплазму, образуют малорастворимые агрегаты [1J, и в этом случае для работы с ними требуются специальные методы их перевода в растворимое состояние. [c.95]

Имеются два общих подхода к осуществлению внутриклеточной экспрессии клонированных генов. Соответствующий ген может быть клонирован в одной рамке считывания с синтетическими или бактериальными кодирующими последовательностями и экспрессироваться с образованием гибридного белка. Другой способ — непосредственная экспрессия встроенного гена. Потребность в экспрессии эукариотических полипептидов в составе гибридных белков возникла, когда было обнаружено, что уровень экспрессии эукариотических белков в клетках Е. oli ограничивается по той причине, что они распознаются клеткой как чужеродные и разрушаются [9]. Это особенно наглядно проявилось в случае полипептидов небольшого размера. При сшивании эукариотического гена с бактериальным синтезировались гибридные продукты, которые накапливались в клетке в значительно больших количествах [10, 11]. Однако, если требуется получить эукариотический полипептид в чистом виде, возникает необходимость в методе, позволяющем правильно расщепить гибридный белок. С другой стороны, непосредственная экспрессия одного эукариотического гена дает возможность получить нужный белковый продукт. Однако первичные продукты трансляции несут на своем Ы-конце остаток метионина. В клетках Е. соН имеются ферменты, осуществляющие при необходимости эффективное отщепление метионина от природных белков однако в случае рекомбинантных белков эти ферменты работают не столь эффективно [1]. Таким образом, белки, полученные в результате прямой экспрессии эукариотического гена, могут содержать несвойственный природному белку N-концевой метионин. [c.98]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

СИЮ клонированного фрагмента гена с образованием включающего AT гибридного белка как в бактериальных клетках, так и в клетках млекопитающих. Это, например, позволяет проводить в клетках млекопитающих эксперименты по локализации и исследованию функциональной активности продуктов гена, экспрессирующегося с образсванкем гибридного белка с AT. Кроме того, это дает возможность сравнивать активности гибридного белка, содержащего AT, в бактериальных клетках и клетках млекопитающих, поскольку и в тех, и в других клетках может работать одна и та же рекомбинантная конструкция. Для проведения многих таких экспериментов требуются моноклональные антитела, обладающие специфичностью по отноще- [c.203]

Рис. 6.8. Специфическая локализация гибридных белков САТ-8У-40 после трансфекции клеток МШЗТЗ рекомбинантными конструкциями на основе челночных векторов. А. Реакция гибридного белка САТ-фрагмент большого Т-антигена (аминокислоты —271) с моноклональными антителами, узнающими К-концевой участок Т-антигена, демонстрирует, что гибридный белок локализуется в ядре. Б. Реакция гибридного белка САТ-фрагмент малого 1-антигена (аминокислоты 1—174) с моноклональными антителами, узнающими уникальный участок последовательности 1-антиге-на, демонстрирует, что гибридный белок локализуется в цитоплазме. Для выявления связывания антител с гибридными белками использовалась пероксидазная система иммунодетекции (как описано в табл. 6.7).

В тех случаях, когда определяющим фактором исследования является оптимальная экспрессия продукта интересующего гена, а возможные ограничения в субклеточной локализации приемлемы или даже желаемы, целесообразно использовать ретровирусный вектор, приспособленный для состыковки генов. Например, вектор рМХ262 (рис. 9.3, г). Он несет множестпснные сайты для клонирования за ЛоЬсайтом гена gag Mo-MLV и позволяет получать рекомбинантные конструкции гена gag, экспрессирующие гибридные белки. [c.284]

Поскольку все описанные на сегодняшний день упаковывающие MLV-клетки ведут свое начало либо от линий NIH3T3 либо от линии BALB/ ЗТЗ, рекомбинантную ретровирусную ДНК в них можно легко ввести путем трансфекции, используя стандартный метод кальций-фосфатной преципитации 34]. Непродолжительная, так называемая временная (transient), трансфекция может оказаться достаточной, чтобы получить вирусный препарат с низким титром (обычно 10—Ю /мл). Однако для достижения более высоких концентраций вируса необходимы стабильно трансформированные клеточные линии, экспрессирующие доминантный селективный маркер. Такие линии позволяют получать препараты вируса с титром Ю —10 инфекционных ед./мл. Титр вирусных препаратов, полученных путем временной трансфекции, можно повысить, если использовать гибридный ретровирусный вектор, содержащий полную область ранних генов вируса полиомы такая конструкция претерпевает в упаковывающих клетках мультикопийную внехромосомную репликацию [35]. [c.288]

Смотреть страницы где упоминается термин Гибридные рекомбинантные ДНК: [c.118] [c.340] [c.133] [c.134] [c.58] [c.60] [c.61] [c.987] [c.470] [c.57] [c.308] [c.107] [c.140] [c.145] [c.174] [c.183] [c.342] [c.162] [c.167] [c.170]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология