Очистка белков

Однако для белков такое соотношение не обязательно выполняется, поскольку они могут связывать и другие, помимо протонов, ионы, которые вносят вклад в общий баланс зарядов (при условии нейтральности молекулы белка). Можно ожидать, что белки в изоэлектрической точке обладают меньшей растворимостью, чем при меньших или больших значениях pH, и это действительно имеет место. Поскольку в изоэлектрической точке молекула белка не обладает избыточным зарядом, в этих условиях белок легче агрегирует и осаждается. Далее, поскольку аминокислотный состав разных белков различен, для каждого белка существует характеристическое значение р/е. Это свойство является основой метода очистки белков путем изоэлектрического осаждения (осаждения в изоэлектрических условиях) pH смеси белков доводится до значения, равного значению р/ искомого белка, так что последний осаждается из смеси. Значение р/г аминокислот с нейтральной боковой цепью равно 5,6 0,5 для аминокислот, содержащих кислые группы, р/ ниже, а для аминокислот с основными группами в боковых цепях — выше. В то же время для белков р/ может меняться от О до И. Вывод формул для расчета р/ аминокислот имеется в большинстве учебников биохимии. [c.32]

Работа 66. Очистка белков методом гель-хроматографии [c.235]

Белки, их химические и физико-химические свойства. Методы выделения и очистки белков классические —диализ, высаживание из растворов современные — распределительное и ионообменное хроматографирование, хроматографирование па молекулярных ситах, электрофорез. Индивидуальность белков. Цветные реакции белков биуретовая, ксантопротеиновая, нингидринная, реакция Миллона. Первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры белков, факторы, опре- [c.248]

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугирования и декантации. Эти методы рассмотрены ниже наряду с аффинной хроматографией на колонках. [c.11]

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ И ОЧИСТКА БЕЛКОВ [c.210]

Резюмируя, можно сказать, что хроматографическое фракционирование и очистка белков на оксиапатите остаются пока методами эмпирическими, где предсказать результаты и дать заранее определенные рекомендации ио выбору оптимальных условий элюции затруднительно. [c.228]

ПРЕПАРАТИВНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ПА РАННИХ СТАДИЯХ ОЧИСТКИ БЕЛКА [c.302]

Впрочем, в вопросе о продолжительности элюции следует проявлять известную осторожность, особенно когда речь идет об очистке белков или других макромолекул. Выше при рассмотрении [c.408]

Нуклеиновые кислоты в качестве лигандов широко используются для очистки белков функционирование которых связано с образованием белково-нуклеиновых комплексов. Эти комплексы удерживаются в первую очередь действием электростатических сил, поэтому элюцию с таких сорбентов ведут повышением концентрации соли. [c.424]

Примеры 13 — 16. Очистка белков иа ДНК-целлюлозе. [c.424]

Другим методом очистки белков, основанным на различии в растворимости, является противоточное распределение по Крейгу [29, 30]. Сегодня оно осуществляется с помощью полностью автоматических установок, позволяющих проводить распределение разделяемых компонентов при многих тысячах ступеней переноса. Состояние равновесия при каждом распределении между двумя фазами описывается законом распределения Нернста. При разделении двух веществ эффект разделения будет тем выше, чем больше фактор переноса 0, равный соотношению коэффициентов распределения к К2. [c.347]

Таким образом, иммунная аффинная хроматография представляет собой инструмент, уже немало использовавшийся для улучшения качества биологических реагентов, и, несомненно, перспективное средство очистки белков и ферментов. [c.111]

Ассистент Сведберга Арие Вильгельм Каурин Тиселиус (1902— 1971), также швед, в 1923 г. разработал более совершенный метод разделения гигантских молекул, основанный на характере распределения электрического заряда по поверхности молекулы. Этот способ — электрофорез — оказался особенно важным при разделении и очистке белков. [c.129]

Обессоливание и смена буфера с помощью гель-фильтрации широко используются в ходе очистки белков и пептидов для освобождения от сульфата аммония или в качестве промежуточной операции, подготавливающей препарат к последующему этапу хроматографии (ионообменной, аффинной или других видов). Если объем раствора белка изл еряется миллилитрами, то рутинную операцию его очистки нередко ведут вслепую . Однажды откалибровав небольшую колонку с сефадексом С-25, последующий отбор фракций, содержащих высокомолекулярные компоненты, производят по объему элюата, нередко просто путем отсчета капель. Соотношение объемов исходного раствора и колонки в этом случае может составлять примерно 1 10. В препаративных вариантах обессоливания, когда желательно максимально использовать объем колонки и избежать разбавления препарата, 5то соотношение можио увеличить до 1 3, контролируя выход хроматографических зон по УсГ-поглощению. Скорость элюции в таких опытах может быть значительной, порядка 20мл/см -ч (скорость продвижения фронта зоны очищаемого вещества по колонке — 20 см/ч). [c.137]

Использование гель-фильтрации для освобождения от радиоактивных предшественников неоднократно цитировалось при описании методов введения радиоактивной метки в белки и нуклеиновые кислоты [Остерман, 1983]. Нередко обессоливание используют и на заключительном этапе очистки для освобождения не только от соли, но и от прочих низкомолекулярных примесей. Например, в одной из работ по выделению РНК-полимеразы очисткой белка на биогеле А-1,5т завершалась целая серия операций, включавшая различные варианты переосаждений белка и ионообмениой хроматографии [Vaisius, Horgen, 1979]. [c.138]

ТСГФ удобно использовать в качестве экономного пробного метода для выбора типа геля и скорости элюции при подготовке препаративной очистки белка гель-фильтрацией на колонке. Малое количество необходимого препарата и возможность одновременного обследования нескольких препаратов делает метод ТСГФ привлекательным и для клиники, где он может дополнить, а иногда и заменить электрофорез и электрофокусирование. [c.165]

ОЧИСТКА БЕЛКОВ СОРБЦИЕЙ НА ALUMINA Су И ГЕЛЕ ФОСФАТА КАЛЬЦИЯ В ОБЪЕМЕ [c.245]

Волокнистые целлюлозы с их лучшими гидродпиамичоскнми характеристиками более удобны на этих ранних этапах, когда экстракты вязки, объем их достаточно велик, а качество разделения фракций может быть еш е не очень высоким. Микрогранулированные целлюлозы, дающ ие примерно вдвое лучшие разрешения, чем волокнистые, следует предпочесть на более поздних этапах очистки белка. [c.288]

Следующий вариант относится к случаям, когда в области pH, обеспечивающей сохранение нативности белка, ои несет достаточно выраженный электрический заряд, т. е. обладает явным сродством к ионообменнику одного тина. Тогда для полной очистки белка можно использовать последовательно два разных ионообменника на одном из них белок сорбировать, затем снять ого ступенчатой элюцией и пропустить через обменник иротивоиоложного типа. Нужный белок пройдет свободно, оставив на колонке примеси, не отделившиеся на первом ионообменнике. [c.305]

Приведенных примеров очистки белков, по-видимолу, достаточно не только для того, чтобы проиллюстрировать некоторые общие положения, но и для того, чтобы обратить внимание читателя па необходимость учета индивидуальных особенностей белка в каждом случае. [c.309]

Кислый аминополисахарид гепарин [М> 10 ООО) известен в качестве антикоагулянта крови. Кроме того, он применяется в биохимии как ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому-отражает некоторое сходство полимера, содержащего две-три суль, фогруппы на каждую дисахаридную структурную единицу, с РНК-Две эти особенности определили использование гепарина в качеств, лиганда для аффинной хроматографии факторов коагуляции крове и (особенно широко) для очистки белков, взаимодействующих и нуклеиновыми кислотами (полимераз, обратной транскриптазы, рес стриктаз, факторов инициации и элонгации белкового синтеза и др.). Кроме того, иммобилизованный гепарин связывает липопротеид-липазы и некоторые липопротеиды. Гепарин-агароза выпускается всеми упомянутыми фирмами-поставщиками аффинных сорбентов, кроме Bio-Rad . [c.370]

Естественно, что еще более эффективную, чем с гепарином, и избирательную очистку белков метаболизма и регуляции матричной активности можно получить, используя в качестве лигандов сами нуклеиновые кислоты. Аффинные сорбенты с иммобилизованными НК могут обладать не только групповой (белки хроматина, нуклеазы, рестриктазы и др.), но и сугубо индивидуальной снецифично- [c.370]

Элюцию вещества с лиганда осуществляют также путем восстановления S—S-свя.зи, пропуская в качестве элюента через колонку раствор цистеина (5—20 мМ в буфере с pH 8), меркаптоэтанола или ДТТ. Примеры режимов элюцпи приведены ниже отметим только, что при очистке белка концентрация восстанавливающего агента в элюенте должна быть минимально необходимой, чтобы избежать восстановления и разрыва внутримолекулярных S—S-связей белка. [c.396]

Аффинную хроматографию на ДНК-целлюлозе использовали па первом этапе очистки белка-продукта гена 32 фага Т4. Зараженные фагом клетки Е. oli вскрывали ультразвуком, бактериальную ДНК [c.424]

Пример 17. Очистка белка на аффинном сорбенте, несущем заранее выбранный участок ДНК [VVeideli, Geliring, 19801. Авторы предложили изящную методику получения аффинного сорбента, несущего вполне определенный фрагмент нативной ДНК. На таком сорбенте с высокой степенью избирательности можно очищать определенный, узнающий именно этот фрагмент белок. Последовательность этапов приготовления сорбента показана на рис. 143. [c.425]

Разделение на основе различной растворимости относится к наиболее старым методам выделения и очистки белков. При изозлектрическом осаждении разделение достигается благодаря минимальной растворимости глобулярного белка в изоэлект-рической точке (ИЭТ). Следует обратить внимание, что ИЭТ белков помимо прочего зависит от ионной силы раствора. ИЭТ некоторых белков приведены в табл. 3-6. [c.346]

Другими важными методами разделения и очистки белков являются злектрофо-рез и ионообменная хроматография. Оба метода основаны на различных свойствах частиц, несущих неодинаковый заряд. Величина и знак заряда для каждого белка характеризуются числом ионизируемых боковых групп аминокислотных остатков и, как в случае аминокислот (разд. 1.4.2), могут быть установлены из кривой титрования. Выше ИЭТ находится зона pH с отрицательным, а ниже. ИЭТ — зона pH с избыточным положительным зарядом молекулы. [c.350]

В начале текущего столетия систематики первыми использовали информацию, получаемую при исследовании растений серологическими методами [77, 116]. Интенсивное применение этих методов до 50-х годов могло показаться довольно бесперспективным, так как иногда получали необъяснимые результаты из-за методического несовершенства, поскольку могли тогда учитывать (с помощью реакций преципитаций, оцениваемых турби-диметрией мутных сред) только крупномасштабные, глобальные явления, отражаемые реакциями между системами — комплексами антигенов и антител. В то время иммуноадсорбция явилась ценным подспорьем в этих исследованиях [82]. Применение антител для изучения растений вновь вызвало интерес после разработки методов осаждения в геле благодаря прогрессу в очистке белков и открывающейся возможности производить и контролировать полиспецифические и моноспецифические сы- [c.111]

Для контроля за степенью очистки белков чаще применяют метод электрофореза. Большинство авторов в качестве носителя используют гомогенные гели или градиент концентрации акриламида. Основной способ при этом — электрофорез в диссоциирующей среде ДДС-Na соответственно процедуре, которую описал Лэммли [68]. В определенных случаях завершающим приемом при этом являются иммунодиффузия [29, 114] либо иммуноэлектрофорез [17, 80, 118]. При исследовании структуры некоторые авторы прибегают к двумерному электрофорезу. Тогда первая миграция молекул может происходить в гомогенном геле полиакриламида с ДДС-Na или без него во втором направлении молекулы мигрируют в полиакриламидном геле с ДДС-Na в присутствии восстановителей дисульфидных связей (р-меркапто-этанол) [10, 40, 61, 78]. Чтобы охарактеризовать субъединицы легуминов гороха и конских бобов, Матта и др. [77, 78] применяют сочетание ДДС-Na с р-меркаптоэнталом и электрофокусированием. Рестани и др. [92 пользуются этим же способом применительно к глобулинам люпина, а Ху и Еэзен [53] демонстрировали гетерогенность белков сои. Указанные методы с [c.155]

Эта процедура позволяет удалять часть липидов и минеральных веществ, но степень очистки белков остается невысокой, особенно при термическом концентрировании. Ультрафильтрация дает наилучшие результаты, позволяя получать продукт, содержащий 53—55 % белков, 5,5% липидов и 11,2% минеральных веществ. С другой стороны, изучено действие на белки, осаждаемые при 85 °С, шести растворителей с различной полярностью [18]. Авторы этой работы приходят к выводу, что такое экстрагирование дает возможность получать продукты, обогащенные белками и обедненные липидами и поэтому меньше окисляющиеся. Их вкусовые и ароматические качества улучшены. Наиболее эффективным растворителем является изопропанол, а неполярные растворители оказывают более слабое действие. Однакл содержание белков остается меньше 75 % даже после двукратного экстрагирования. [c.480]

Применение ионообменников. Ионообменные смолы сферосил, разработанные французской фирмой Рон-Пуленк , пригодны для очистки белков водных экстрактов. В таблице 9.40 приведены характеристики полученных продуктов. [c.486]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология